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Tecnología del DNA
recombinante
Dra. Elena Alvarado León
Dpto. de Morfología Humana

DNA recombinante
DNA recombinante: asociación nueva entre
fragmentos de DNA que no se encuentran
juntos normalmente.

Propiedad básica del DNA :
El acoplamiento de cadenas por complementariedad.
La extraordinaria especificidad del reconocimiento
entre secuencias de bases complementarias
constituye un poderosoinstrumento para la
identificación, aislamiento, clonación, de fragmentos
de DNA complementarios a uno dado

DNA recombinante
Secuencia para la creación de
molécula de DNA recombinante:

una

1. Obtención de los fragmentos de
DNA que se quieren manipular (DNA
foráneo, DNA diana, DNA clonado, el
inserto de DNA) utilizando enzimas
de restricción
2.

Unión de los segmentos de DNA
con otras moléculasdenominadas
vectores de clonación

3. Introducción
del
DNA
recombinante
en
células
hospedadoras, donde se replicará y
producirá numerosas copias idénticas
o clones

R

R

R

Digestió amb l'enzim de restricció

R

Unió

Plasmidi recombinant
Transformació
de bacteris

Cromosoma
bacterià

Plasmidi

Cultiu bacterià amb
moltes còpies del
DNA clonat

Tecnología del DNA recombinante
Molécula A

MoléculaB

Digestión de ambas moléculas con la
misma enzima de restricción, BamHI
Extremos
cohesivos
Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

HERRRAMIENTAS: ENZIMAS DE
RESTRICCION
• Descubiertas por W. Arber, H. Smith y Nathans a
fines de los 60
• Reconocen secuencias específicas en el DNA de
doble cadena

• Cortan ambas cadenas en lugares concretos
• Reconocen secuencias específicas de 4-8pares
de bases

Tipos de enzimas de restricción
• Tipo I: Realizan corte y metilación, requieren de
ATP, cortan sitios aleatoriamente,distintos del
sitio de reconocimiento
• Tipo II: Realizan corte, no requieren ATP, cortan
dentro del sitio de reconocimiento
• Tipo III: Corte y metilación, utilizan ATP,cortan
sitios aleatorios cerca de los sitios de
reconocimiento

Tecnología del DNA recombinanteClonación: vectores y hospedadores

Para conservar y propagar los fragmentos de DNAen el
interior de las células hospedadoras, es necesario emplear
unos vehículos que los transporten: vectores de
clonación.
Características:
-Capacidad para replicarse autónomamente en el interior
de las células hospedadoras

-Capacidad para aceptar fragmentos de ácido nucleico
heterólogo, el cual se propaga ymantiene junto al vector
-Poseen un marcador seleccionable que facilita la
identificación de las células dónde ha insertado
-Su recuperación de las células hospedadoras no ha de
implicar ninguna dificultad

Tecnología del DNA recombinante
Clonación: vectores y hospedadores

VECTORES DE CLONACIÓN
Vectores plasmídicos con alto número de
copias de tipo estándar
Vectores de inserción del fago lambdaVectores de reemplazamiento del fago lambda
Vectores cosmídicos
Bacteriófago P1
Vectores PAC (cromosomas artificiales de P1)
Vectores BAC (cromosomas artificiales de bacterias)
Vectores YAC (cromosomas artificiales de levadura)

TAMAÑO DEL
INSERTO
0 a 10kb
0 a 10kb
9 a 23kb
30 a 44kb
70 a 100kb
130 a 150kb
hasta 300kb
200 a 2000kb

Capacidad de clonación de los diferentes tipos de vectores

Los másutilizados: plásmidos,
bacteriófagos,
cósmidos y los cromosomas artificiales de levadura

Tecnología del DNA recombinante:
Clonación: vectores y hospedadores

Plásmidos: Moléculas circulares extracromosómicas de DNA
bicatenario, heredadas de manera estable durante las sucesivas
generaciones celulares. Los más utilizados son del tipo
multicopia.
EcoR I Cla I Hind III

(A)

BamH I
Sph I
Sal I

Rru IPvu I
Pst I

Resistència
a ampicilina

Xma III

Resistència
a tetraciclina

(B)

Nru I

lacZ' + MCS

pBR322
ori

Ava I
Bal I

ori

r
amp
Sna I

ATG

1

2

3

4

5

6

THR

MET

ILE

THR

ASN

SER

ACC

ATG

ATT

AAT

TCG

ACG

EcoRI

Pvu II

(1
ser

2

3

4

5

6

7

8

ser

val

pro

gly

asp

pro

leu

AGC TCG

Sst I

GTA

CCC GGG GAT

KpnI

CCT

BamHI
Sma I
XmaI

9

10

11

12

13

14

glu...