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MICROORGANISMOS CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS

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4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de unfilamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en elfondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas sonde PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio
(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón.Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergenen un recipiente con alcohol y se pasan por la

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llama de un mechero. Antes de sembrar, se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama, sin que toque ninguna superficie. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. Código de identificación 2. Tipo de análisis 3. Concentración del inóculo En lasplacas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias. 4.1.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento. Siembra escocesa. Se basa en arrastrar, con el asa de Kolle, un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa dePetri. El objetivo es conseguir colonias aisladas.

Fig. 4.2 Metodología 1. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. 2. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. 3. Para siembra en estría,poner el asa suavemente sobre el agar, haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. 4. Para siembra escocesa, hacer una serie de estrías paralelasy no superpuestas hasta que se agote el asa (fig.4.2) 5. Esterilizar el asa de siembra. 6. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. 7. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. 8. Incubar 24- 48 h. a la Tª adecuada. Si la siembra ha sido correcta, los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr. o ml. de la muestra. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema. Se basa en...
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