Acido nucleicos

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Química Biológica I TP 10 DNA: extracción, identificación y reconocimiento

OBJETIVO: -Utilizar técnicas sencillas para extraer ADN de tejido vegetal. -Extraer ARN de levadura -Reconocer los componentes estructurales del ARN y ADN. FUNDAMENTO: Los ácidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden encontrar en las células asociados a proteínas formandocomplejos llamados núcleo-proteínas. Estas proteínas tienen carácter básico mientras que los ácidos nucleicos son ácidos. Se conocen dos grupos de ácidos nucleicos: RNA (ácido ribonucleico) y el DNA (ácido desoxirribonucleico). La hidrólisis controlada de RNA y DNA produce nucleótidos. Si la hidrólisis continúa se producen nucleósidos y finalmente fosfatos, azúcares y bases púricas y pirimidínicas. Lafunción biológica de los ácidos nucleicos es fundamental: el DNA está asociado con el material genético de las células, pudiendo encontrarse como una sola cadena en algunos microorganismos o formando parte de núcleo-proteínas de los cromosomas en organismos superiores. Almacena información genética y sirve de molde para la síntesis de proteínas. Se encuentra mayoritariamente en el núcleo y en muypoca cantidad en mitocondria y cloroplastos. El RNA participa en la síntesis de proteínas y se distribuye en toda la célula, mayormente en citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas. El protocolo básico de extracción de DNA consiste en el tratamiento del homogeneizado con disolventes orgánicos (fenol, cloroformo o ambos) Para evidenciar la presencia de ácidos nucleicos en extractoscelulares vegetales se requiere células en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular o hidrólisis de los ácidos nucleicos por nucleasas. Una completa extracción de ácidos nucleicos es fundamental para la determinación indirecta. Una hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas (hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas)sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotídico, por lo tanto obtenemos como producto ácidos nucleicos sin bases púricas. Las desoxipentosas debido a la hidrólisis ácida sufren deshidratación dando aldehídos δhidroxi-levulínicos. Estos reaccionan con difenilamina dando un producto de color azul. Así, la reacción de difenilamina servirá para caracterizar, indirectamente, lapresencia de DNA en células de cebolla.

La pentosa del DNA y RNA puede evidenciarse por la reacción con orcinol. El ácido sulfúrico hidroliza las uniones fosfodiester y N-glicosídicas, liberando ribosa, bases púricas, pirimidínicas y acido fosfórico. La pentosa en medio ácido se deshidrata originando furfural que reacciona con el orcinol dando un producto verde que demuestra la presencia de DNA yRNA.

El grupo fosfato se identifica por la reacción para fósforo inorgánico, en medio ácido, con el molibdato (reactivo 1) da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido luego por el ácido ascórbico (reactivo 2) a azul de molibdeno, color azul verdoso. El reactivo 3 (arsenito/citrato) se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con otros fosfatos.

Parteexperimental: EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DNA DE CELULAS VEGETALES. Reactivos Solución de lisis: 0,1 % de SDS en 25 mM EDTA pH 8,0 Alcohol etilico 95% Rvo difenilamina: 0,2 g en 20 ml de ácido acético glacial y adicionar 0,5 ml de ácido sulfúrico. (Preparar en el momento) Rvo Bial: 1,5 g de orcinol en 500 ml de HCl cc y 20 gotas de cloruro férrico 100 g/l

Pelar y rallar una cebolla mediana conrallador o procesador hasta picarla finamente. Pesar 10 g de cebolla rallada y adicionar 25 ml de solución de lisis y dejar 20 min. a t° amb. Filtrar en gasa y recoger en probeta. Transferir 4 ml de filtrado a un tubo de ensayo. Adicionar 2 volúmenes de etanol 95% procurando no mezclar las dos soluciones. En la interfase observar la formación de una fina hebra. Aspirar la interfase con pipeta Pasteur...
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