Actividad antioxidante

Actividad antioxidante de la ficocianina frente a radicales peroxílicos y la peroxidación lipídica microsomal
Métodos
El 2,2'-azobis(2-amidinopropano) (ABAP) es un compuesto que por termólisis y en presencia de oxígeno genera radicales peroxílicos a una velocidad conocida y constante. Este compuesto fue utilizado para evaluar la interacción entre la ficocianina y los radicales peroxílicos,mediante el monitoreo de la disminución de la absorbancia a 620 nm de la ficocianina y el efecto que esta ejerce sobre la lisis inducida por ABAP en eritrocitos humanos. Además se estudió si la ficocianina inhibe la peroxidación lipídica inducida por Fe+2-ascórbico en microsomas aislados de hígado de rata. En todos los estudios se utilizó ficocianina obtenida en el Centro Nacional de InvestigacionesCientíficas (CNIC) a partir de Arthospira máxima2y purificada según el método de Neufeld y Riggs.3
El monitoreo de la banda de absorción del cromógeno se realizó en un espectrofotómetro Hewlett Packard 8453 a 37 °C luego de la adición de ABAP (10 mmol) a diferentes concentraciones del cromógeno (7-30 mmol).
Los ensayos de hemólisis mediada por radicales peroxílicos se evaluaron según el métodode Sigiyama y otros.4 A una suspensión a 20 % de eritrocitos en 0,34 mol NaCl/10 mmol fosfato de potasio pH 7,4, se le adicionó el mismo volumen de ABAP 150 mmol y diferentes concentraciones de ficocianina, trolox (análogo hidrosoluble de la vitamima E) o ácido ascórbico (vitamina C), utilizados los 2 últimos como antioxidantes (hidrosolubles) de referencia. La mezcla de reacción se incubó a 37 °Ccon agitación moderada durante 180 min.
Para el estudio de la inhibición de la peroxidación lipídica se aislaron microsomas de hígado de rata mediante ultracentrifugación diferencial y se incubaron (1,3 mg/mL) a 37 °C en tampón Tris 50 mmol pH 7,4 antes de la inducción de la peroxidación lipídica con 10 mmol de FeSO4 y 0,2 mmol de ácido ascórbico recién preparado. Posteriormente se tomaron 0,3mL de la mezcla de reacción y se añadieron a 2 mL de TBA-TCA-HCl-BHT frío. Luego de calentar por 15 min a 80 °C y centrifugar por 15 min a 2 000 g se determinó la absorbancia a 535 nm.5
Resultados
La exposición de la ficocianina a la fuente de radicales conduce a una pérdida progresiva de la absorbancia a 620 nm, esto indica que la conjugación de la parte bilínica de la proteína se reduceconsiderablemente como consecuencia de su interacción con los radicales peroxílicos. A partir de la máxima velocidad de decoloración medida, y considerando un peso molecular de 13 000 para cada grupo bilínico, se obtuvo una velocidad máxima de eliminación de estos grupos de 0,92 mmol/min, que si se compara con la velocidad de producción de radicales peroxílicos en estas condiciones experimentales (0,75mmol/min), se puede concluir que el blanco principal de ataque de los radicales peroxílicos son los grupos cromógenos y que la reactividad de estos es considerablemente mayor que la de la parte proteica (apoproteína).
Cuando el ABAP se añade a la suspensión de eritrocitos este induce hemólisis dependiente del tiempo y de la concentración utilizada de dicho producto, que es inhibida por lasdiferentes dosis de ficocianina empleadas en la misma forma que los otros 2 antioxidantes evaluados (tabla). Si se considera la CI50, definida como la concentración de aditivo que produce 50 % de inhibición del daño peroxidativo, se observa que la ficocianina resultó ser entre 6 y 7 veces más eficiente que el trolox y el ácido ascórbico.
Tabla. Porcentaje de hemólisis inducida por radicales peroxiloy su inhibición por antioxidantes
Aditivo | % Hemólisis | % Protección
por el aditivo | CI50 (mmol) |
Ninguno | 92,2 ± 5,4 | - | - |
Ficocianina | | | |
0,012 mmol | 88,0 ± 2,4 | 12,0 | |
0,025 mmol | 75,5 ± 8,2 | 24,5 | 0,10 |
0,05 mmol | 12,5 ± 1,0 | 87,5 | |
0,075 mmol | 2,3 ± 0,5 | 97,7 | |
Trolox | | | |
0,5 mmol | 78,5 ± 3,3 | 21,5 | |...