Aislacion y propiedades quimicas de la hemoglobina

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
FACULTAD DE QUIMICA

CURSO
LABORATORIO DE BIOQUIMICA QIM-117

SECCION
3

PROFESOR
CLAUDIA BUENO

FECHA EJECUCION
LUNES 28 DE MARZO DEL 2011

EXPERIENCIA 2:
Aislación y Propiedades Químicas de la Hemoglobina

Leonel Cortes M
1º Semestre 2011

Objetivos Específicos:

• Aislar Hemoglobina a partir de la sangre humana• Caracterizar cada una de las distintas formas que adquiere la hemoglobina, dependiendo del ligando unido y del estado de oxidación del hierro.
• Estudiar la formación de la metahemoglobina
• Estudiar el efecto de la concentración de sal en los eritrocitos.

Resultados Obtenidos

Preparación de Hemoglobina:
La hemoglobina fue preparada de la siguiente manera: 20 mL de sangrehumana fueron lavado con una solución de cloruro de sodio al 1,2%, luego aquella solución de centrifugo por 10 minutos y se descarto el sobrenadante turbio, se hizo este paso hasta que el sobrenadante quedo claro. A continuación se separaron 3 mL de la sangre pura para realizar el test del efecto de la concentración salina. El volumen restante ( 13,3 mL) de sangre fue sometido a hemólisis adicionando13,3 mL de agua y 4,5 mL d tolueno, estos componentes se mezclaron en un embudo de decantación y se dejaron ahí durante 45 min. Luego de pasado el tiempo se procede a extraer la fase acuosa que es la que contiene el objetivo, hemoglobina en forma de oxihemoglobina ya que es inevitable la presencia del oxigeno en el ambiente.
Espectro de absorción de la hemoglobina:

Este espectro fue obtenidomedido de la dilución 5 mL de oxihemoglobina aislada con agua destilada hasta una absorbancia de 0,5 -500 nm. Esta fue medida en el rango 450-650 nm.

Espectro de la desoxihemoglobina:

El espectro de absorción de la desoxihemoglobina fue preparado mediante la adición del reactivo de Stokes a 5 mL de oxihemoglobina (A500= 0,5). Se espero 20 minutos a que concluyera la reacción y posteriormentese procedió a medir la absorbancia en los rangos 450 -650 nm.

Espectro de la Nitrosilhemoglobina:

El espectro de la Nitrosilhemoglobina fue preparado mediante la mezcla de 5 mL de oxihemoglobina (A500= 0,5), 0,5 mL de acido ascórbico 0,5 mol/L, 0,5 mL de fosfato de potasio 0,2 mol/L a ph 7 y 0,5 mL de una solución de nitrito de sodio 0,5 mol/L. Se procedió a leer la absorbancia entre losrangos 450-650 nm.

Espectro de la metahemoglobina:

El espectro de absorción de la metahemoglobina fue preparado mediante la mezcla de 5 mL de solución de oxihemoglobina (A500= 0,5) y 1 mL de solución de ferricianuro de d potasio 0,2 %. Luego se procedió a medir la absorbancia en los rangos 450-650 nm.

Test de efecto de la Concentración Salina

|Conc. De Sol. NaCl % |Vol.Total 10 mL |
|0 |0 |
|1,2 |9,4 |
|5.0 |7,5 |
|10 |5 |
|20 |10 |

Fueron utilizados cinco tubosde ensayo para esta experiencia, a los 5 tubos se le adicionó el volumen de solución salina que se indica en la tabla y se completo con agua destilada cada tubo hasta alcanzar un volumen común de 10 mL. Se dejaron reposar lo tubos durante toda la noche y al día siguiente se observaron y anotaron los datos.

Discusión

Respecto de la oxihemoglobina:

El grafico Absorbancia v/s Longitud deonda obtenido se asemeja mucho al bibliográfico por lo que se puede decir que la proteína aislada sí corresponde a la oxihemoglobina. Además el aspecto físico de la oxihemoglobina fue un color rojo brillante tal como el que experimenta normalmente. El rango medido fue entre 450 y 650 nm puesto que a esas longitudes de onda absorbe mas el compuesto.

Respecto de la Desoxihemoglobina:

La...
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