aislacion y purificacion de una proteina en la leche: alfa lactoalbumina.








LABORATORIO N° 1 BIOQUIMICA
AISLACION Y PURIFICACION DE UNA PROTEIBA DE LA LECHE: α-LACTOALBUMINA









Fecha: Jueves 27 marzo 2014




RESULTADOS:
Curva calibrado:
Muestra
Concentración
Absorbancia
1
0
0
2
0,067
0,023
3
0,133
0,044
4
0,2
0,067
5
0,267
0,095
6
0,333
0,114


Formulapara concentracion
x=(y+0,0007)/0,3469
Absorbancia Muestra diluida
0,09
Concentración Muestra diluida
0,261458634
Concentración Muestra original
0,522917267

Concentracion en mg de α-lactoalbumina en leche:
0,26145 mg en 0,5mL => 0,5229mg/mL



DISCUSIÓN:
En este laboratorio se pretende cuantificar la cantidad de α-lactoalbumina en la leche descremada. Se aísla y purifica la proteínapor una serie de pasos que involucran precipitación con sales y cambios de pH.
Para aislar la proteína utilizamos 50mL de leche descremada en un vaso de precipitado de 400mL y la sometimos a calentamiento hasta los 40°C aprox. Luego le adicionamos 10gr de sulfato de sodio anhidro en pequeñas porciones durante 12 minutos aprox y revolviendo constantemente, se sigue revolviendo por 10 minutos más ydespués filtramos con succión suave en embudo de Buchner. Este paso es importante para disminuir el agua disponible, lo que produce una menor interacción con la proteína y así poderla precipitar más fácil.
Para deshacernos de la caseína vamos a someter la disolución a un pH ácido (pH=3) y así disminuimos la interacción de la α-lactoalbumina y la lograremos precipitar gracias a que esta estaráprotonada y es insoluble en estas condiciones. Utilizaremos la centrifuga para poder realizar una buena separación y en el precipitado encontraremos la proteína deseada junto a otras, pudiendo deshacernos del sobrenadante.
Para obtener una mejor purificación resuspenderemos la proteína en agua destilada y ajustaremos el pH a 9 aprox con NaOH 0,1N. En este paso también nos basamos en las propiedadesacido base específicas de la proteína que queremos obtener, llevándola a un pH en el cual esta se hace soluble denuevo por su estado ionizado y por ende sus posibilidades de interacción con el disolvente. Tuvimos que centrifugar dos veces, ya que, después de la primera vez el sobrenadante aun se veía medio turbio lo que nos indicaba que la proteína no estaba tan pura es suspensión y nuestroobjetivo es lograr que este lo más pura posible, por ende, centrifugamos denuevo.
Es importante reiterar que estas prácticas se pueden realizar, y logramos separar proteínas, gracias a que todas las proteínas son diferentes lo que les otorga diferentes pKa, diferentes propiedades acido/base y diferentes interacciones son los disolventes.
Se obtuvo la concentración de la proteína por medio de una curvade calibrado patrón realizada con una disolución estándar de concentración 2mg/ml de BSA. Esta disolución estándar fue preparada por nosotros mismos a partir de una de concentración 5mg/ml, por lo que puede haber un pequeño error en la concentración teórica de los estándares que conforman la curva de calibrado, y por ende, del resultado de la muestra.
Los puntos de la curva fueron realizadostodos por el mismo operador para reducir el error de procedimiento. Se hicieron 6 puntos de la curva, cada uno de un mL en total de volumen, por lo que se añadió, 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 y 1 mL de disolución estándar (0.2mg/ml de BSA) respectivamente y el volumen restante de agua destilada.
El método elegido fue el de Biuret. Este método se basa en la interacción de sustancias con dos o más enlacespeptídicos con sulfato de cobre. En el proceso se coordinan los átomos de nitrógeno peptídicos con los iones Cu2+ y se forma un complejo de color azulino (purpura) que absorbe a 540nm. A mayor cantidad de proteína disuelta más intenso es el color.
Sobre cada tubo preparado para la curva de calibrado (los cuales cada uno debe tener 1mL total de volumen según lo explicado anteriormente) se debían...