Aislamiento De Linfocitos Y Monocitos De Sangre Periférica.

AISLAMIENTO DE LINFOCITOS Y MONOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA.

1.- INTRODUCCIÓN

El primer paso de numerosos análisis inmunológicos es el aislamiento de la fracción "mononuclear", es decir,linfocitos y monocitos, de sangre periférica. El método de aislamiento más utilizado se fundamenta en las diferentes densidades que presentan cada uno de los tipos celulares de la sangre (Figura 1).Para conseguir la separación, la muestra de sangre se deposita sobre un líquido de densidad 1.077 g/ml, denominado Lymphoprep o Isolymph, y se centrifuga para acelerar la separación. El Lymphoprep estácompuesto por ficoll y metrizoato sódico. El ficoll aglutina los eritrocitos, de manera que aumenta su velocidad de sedimentación. El metrizoato sódico es el compuesto que da la densidad adecuada.2.- OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:
Aislar la fracción linfomonocitaria de una muestra de sangre anticoagulada.


3.- EQUIPAMIENTO

- Tubos depoliestireno de 5ml y gradilla.
- Pipetas y puntas
- Centrífuga

4.- REACTIVOS


- PBS pH 7.2
- Medio de separación de linfocitos Ficoll – Metrizoato sódico (ej. Lymphoprep )
-Muestras de sangre anticoagulada (ej. tubos anticoagulados con EDTA descartes de hemogramas )

PROCEDIMIENTO

1) Sangre anticoagulada (EDTA, citrato, heparina...) o sangre desfibrinada.
2)Diluir 1/2 con PBS o suero salino.
3) Pipetear cuidadosamente sobre medio volumen de Lymphoprep (p.ej. 6ml sangre diluida : 3ml de Lymphoprep). Evitar que la sangre y el medio de separación semezclen.
4) Centrifugar a 800g x 20 min a T.A (apr. 20°C) en un rotor oscilante. Si la sangre ha sido extraida hace más de 2 horas, centrifugar 30 min.
5) Recoger la fracción mononuclear y diluircon PBS o suero salino.
6) Centrifugar a 250g x 10 min a T.A.
7) Decantar o aspirar el sobrenadante (rico en plaquetas) y repetir el paso 6.
8) Resuspender el pellet celular en medio de...