Aislamiento y Puridicación De La Lisozima

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA
Gutiérrez Hernández J.
Departamento de Bioquímica, Facultad de Biológicas, Universidad Complutense de Madrid, España.

RESUMEN
Se aisló y purificó lisozima de clara de huevo marrón por tratamiento ácido y térmico y posterior cromatografía de penetrabilidad en Sephadex G-75. El producto obtenido tuvo una actividad específica de 2.980 UAL pormiligramo de proteína, representando una purificación de 5’88 veces. La actividad específica observada por esta enzima fue 1’11 veces menor que la que se observa en la purificación por cromatografía de intercambio iónico. Por medio de electroforesis SDS-PAGE se obtuvo un peso molecular aparente de 14.600 daltons. Los resultados han sido comparados contra los obtenidos por otros grupos de investigación quellevaron a cabo la misma purificación en paralelo, que realizaron cromatografía de intercambio iónico en Amberlita.

INTRODUCCIÓN
Se ha trabajado con lisozima, enzima ampliamente distribuida en la naturaleza, también conocida como muramidasa y que posee actividad hidrolítica de enlaces glucosídicos β (1-4) del péptidoglicano de la pared celular bacteriana. Su efecto bacteriolítico fuedescrito por primera vez por Fleming en 19221. La lisozima ha sido considerada como parte importante de un mecanismo primitivo de defensa en una gran variedad de organismos, los cuales carecen de un sistema inmunológico bien desarrollado2, mientras que en organismos superiores la lisozima se encuentra en secreciones y tejidos mucosos con la función de protección bacteriana. La lisozima fue la primeraenzima secuenciada, la primera de la que se dispuso de un modelo tridimensional por cristalografía de rayos X y la primera para la que se propuso un mecanismo catalítico detallado3.
De todas las proteínas pertenecientes al grupo de lisozimas, la más estudiada es la de clara de huevo de gallina (Gallus gallus), con un punto isoeléctrico de 11 (dos unidades de pH superior al del resto de lasproteínas de la clara del huevo) y un peso molecular bajo, en torno a 14.500 daltons.
El presente trabajo describe el aislamiento y purificación de la lisozima de la clara de huevo marrón de gallina, así como la actividad y cantidad de proteína presente en las distintas fracciones que se fueron obteniendo con el fin de establecer el grado de purificación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Huevo marrón de gallinaFacilitado por el personal del departamento de Bioquímica de la Facultad de Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid (UCM). Se separó la yema de la clara, la cual se sometió al análisis en el laboratorio.
Reactivos
Sephadex G-75: casa comercial Pharmacia
Bradford: casa comercial BIO RAD
BSA: casa comercial Sigma
Paredes de Micrococcus lysodeikticus: casa comercial Sigma
Patrones demasa molecular: casa comercial BIO RAD
Acrilamida / Bisacrilamida / SDS / Glicocola: casa comercial SERVA
Persulfato amónico / Tris: casa comercial SERVA
TEMED: casa comercial BIO RAD
Azul de Bromofenol: casa comercial Fluka
Azul de Coomassie: casa comercial Sigma
Ácido acético y Metanol: casa comercial Scharlab S.L.
Azul de dextrano y Ferricianuro potásico
Purificación de la lisozimaLa clara de huevo se sometió primero a un tratamiento ácido diluyéndola ¼ con ácido acético 0’1 M, agitando durante 5 minutos y se filtró con gasa doble. La clara diluida y filtrada se centrifugó durante 5 minutos a 4.500 rpm. Se tomó el sobrenadante (E1) para continuar con el proceso de purificación, guardando previamente 1 mililitro para valorar proteínas, ensayar la actividad enzimática yrealizar la electroforesis. A continuación se sometió a tratamiento térmico incubándolo en baño de agua a 60ºC durante 5 minutos. Se enfrió en baño de hielo otros 5 minutos y se centrifugó a 4.500 rpm por 5 minutos. Se tomó el sobrenadante (E2) para continuar y se volvió a guardar una alícuota de 1 mililitro para valorar proteínas, medir actividad enzimática y someterla a separación electroforética....