Aislamiento

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso depurificación.
 
A)    MÉTODOS DE ESTIMACIÓN - UNIDADES
El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad mediante el cual pueda valorársela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificación tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y después de ese paso, y comparar los resultados de variosprocedimientos posibles. Sólo en términos cuantitativos se puede saber si se ha producido algún progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima está dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que ésta sea una operación rápida; es preferible sacrificar precisión por rapidez en las determinaciones.
 
La naturaleza del ensayodependerá del tipo de reacción que cataliza la enzima. A veces resultará conveniente la medición de la aparición de un producto y otras la medición de la desaparición de sustrato.
 
La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH, concentración; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades. La elección del sustrato es muyimportante: debe ser barato, de fácil determinación, estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentración tal que sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la concentración de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima.
 
En general, en los tejidos, una enzima puede estar presente en una proporción de 1/10 a 1/100 del materialtotal. Es necesario definir una unidadenzimática arbitraria para poder expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificación. La unidad enzimática se define en forma particular para cada reacción según sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formación de una determinada cantidad de producto (desaparición dereactivo) en un tiempo dado.
 
La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica que es el cociente de actividad enzimática (expresada en unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas.
 
B)   FUENTE DE LA ENZIMA
La actividad de una enzima varía considerablemente en diferente organismos y aún en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudiosmecanísticos generales, debeseleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la mayoría de las enzimas se deterioran rápidamente. Frecuentemente una buena elección de la fuente de enzima permite simplificar la extracción y purificación de la enzima.
 

C)   IMPORTANCIA DE LA LOCALIZACION INTRACELULAR DE LA ENZIMA
Las enzimas puedenlocalizarse dentro de los siguientes grupos:
I.  Enzimas en solución verdadera en el citoplasma. Permanecen en el sobrenadante luego de la eliminación de los componentesparticulados. La ruptura de las células en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio.
II. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden encontrarse a) en “solución” dentro de unamemrana ypueden ser extraídas después de la destrucción de la misma; b) asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solución debe disociarse el complejo.
 
El conocimiento de la localización intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido desarrollar procedimientos de extracción diferencial que facilitan la purificación.
 
D)  EXTRACCION DE ENZIMAS
Las condiciones para...
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