Analisis de proteinas

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ANALISIS DE PROTEINAS (SEGÚN LOWRY)
Modificado por Raghupathi & Diwan (Anal. Biochem. 219: 356-359, 1994)

El método de Lowry está basado en la reducción del reactivo de Folin-ciocalteu a
Azul detungsteno o azul de molibdeno, ambos absorben fuertemente entre 600 y 800 nanómetros, lo que puede ser estimado espectrofotométricamente. Esta reacción aumenta al pre-tratar la muestra con iones decobre en medio alcalino. La modificación del método original radica en que la diferencia en color obtenido a través de la reacción de las proteínas en presencia y ausencia de cobre, eliminando así lainterferencia de al menos 4 compuestos que afectan el método original.

I. Preparación del extracto:
1) Pesar entre 10-15 mg (cercano a 10 mg) de muestra liofilizada en un tubo de ensayo.
2) Añadir0,5 mL de NaOH 0,5 N (20g NaOH/L) (5g NaOH/250 mL).
3) Agitar, sonicar por 3 minutos y agitar nuevamente.
4) Permitir la extracción incubando las muestras por 2 horas a 60ºC.
5) Adicionar 4,5 mLde NaCl 0,145 M (8,5 g NaCL/L) (2,125 g NaCl/250 mL).
6) Vortex y centrifugar por 5 minutos a 1000 rpm.

II. Preparación de curva de calibración (BSA):

|TUBO |µL de Stock de BSA|µL NaOH 1M |[µg BSA/mL] |
|1 |0 |800 |0 |
|2 |10|790 |25* |
|3 |20 |780 |50 |
|4 |30|770 |75 |
|5 |40 |760 |100 |
|6|80 |720 |200 |
|7 |160 |640 |400 |
|8...
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