Anemia

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  • Publicado : 18 de agosto de 2012
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La implementación exitosa de polimorfismo de nucleótido simple (SNP) de la detección de la investigación clínica y la administración de la medicina adaptada al genotipo de un individuo, los llamados 'medicina personalizada', radica en la capacidad de ofrecer pruebas muy fiables, precisos y de bajo costo que pueden discriminar entre polimorfismos de ADN clave. Las empresas de biotecnología yfarmacéutica han abordado este reto con el desarrollo de metodologías, incluyendo un solo capítulo de análisis de polimorfismo de conformación, análisis de heterodúplex y la electroforesis en gel de desnaturalización. Cada una de estas técnicas se basa en la conformación, los cambios inducidos por la movilidad de gel (1). Simples ensayos homogéneos basados ​​en la transferencia de energía de resonanciafluorescente, espectrometría de masas o secuenciación directa de productos de PCR también han demostrado ser instrumentos eficaces para la detección de SNP (2). La aplicación de estos métodos pueden requerir síntesis reactivo específico y purificación aguas abajo, haciendo que complicado y caro.
Sin embargo, los ensayos basados ​​en PCR para el diagnóstico de SNP tiene un amplio potencial en eldiagnóstico clínico debido a su simplicidad inherente y de bajo costo potencial. Establecidos basados ​​en la PCR metodologías incluyen algunos ensayos ligadura (3,4), el análisis genético poco (5), vistió a la extensión del cebador (6) y la restricción de polimorfismos de longitud de fragmentos (7), y el uso de secuencias específicas de sondas fluorescentes (8).
PCR también ha sido adaptado parala detección de SNPs bien caracterizado mediante amplificación específica de alelo (ASA); oligonucleótidos complementarios a una secuencia de DNA dada a excepción de un desajuste en su 3'-hidroxilo residuo no funcionará como cebadores en la PCR bajo apropiado condiciones. Un típico ensayo ASA se compone de dos reacciones complementarias, cada una contiene un cebador común, un cebadoralelo-específicas y Taq ADN polimerasa carece 3 '→ 5' actividad corrección de pruebas. La primera reacción contiene un cebador específico para la secuencia de ADN normal (o de tipo salvaje) y refractario a la amplificación de ADN mutante en un locus dado. De manera similar, la segunda reacción contiene un cebador mutante específico incapaz de amplificar el ADN de tipo salvaje. Conformación molecular seconsigue mediante el análisis de los perfiles de amplificación de PCR resultantes. Un individuo normal generará producto en la primera reacción solamente; un heterocigoto amplifica productos en ambas reacciones, y un individuo mutante homocigótico lo hace sólo en la reacción mutante específico. Amplificación de control interno es necesario, proporcionar un control positivo de la prueba PCR (9).ReactivosMétodo
Reactivos de PCR (polimerasa Taq ADN, SA TaQUANT-OFF, 10 x Mg libre de tampón Taq, 25 mM MgCl 2) se obtuvieron a partir de Q-Biogene (CA), a excepción de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP), que eran de Promega (Reino Unido). Primer selección se llevó a cabo utilizando el paquete de software PrimerCalc © (Q-Biogene). Por electroforesis en gel estándar, biología molecular gradode agarosa se ​​utilizó (Q-Biogene) en 0,5 x tampón TBE (45 mM Tris, 45 mM borato, 1 mM Na2EDTA, pH 8,3). Agua desionizada doble (18 MW) se utilizó para todos los tampones y soluciones para la electroforesis y amplificaciones de PCR. HbS homocigota ADN genómico humano y heterocigotos HbA / S de ADN fueron un generoso regalo del Servicio de Referencia Nacional de hemoglobinopatías (Oxford, ReinoUnido).

Bidireccionales alelo-específicas de PCR amplificaciones
WT-AS (5'-ATG CTG GTG CAC TCA AAC GA-3 ') y WT-CP517 (5'-CCC CTT CCT ATG ACA TGA TCA-3') fueron diseñados para la amplificación de un fragmento de 517 pb de la β normales gen de la globina (de tipo silvestre primer set). MUT-AS (5'-CAG CGG CAG ACT TAA TCT CCA-3 ') y MUT-CP267 (5'-GGG TTT CAA GAA GTC CTC CTA-3') fueron diseñados...
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