Arn recombinante

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ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN CELULAR

La técnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulación de la expresión génica, en la regulación de la producción comercial de síntesis de proteínas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgénicos y en la amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número de copias de un gen determinado.En este último caso, existe una técnica mejor, denominada con las siglas PCR.

La técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y éste, a su vez, dentro de una célula, denominada célula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizándose así la proteína codificada en el gen. Además, al dividirse la célula, las nuevas células formadascontienen ese gen que también sintetizan esa proteína. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto.

Las etapas en la producción de ADN recombinante son las siguientes:

Preparación de la secuencia del ADN para su clonación

Preparación de un vector de clonación

Formación del ADN recombinante

Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona

Propagación delcultivo

Detección y selección de clones recombinantes


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Preparación de la secuencia del ADN para su clonación

Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.

Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).

Las proteínas estructurales, enzimas, ARN yrestos moleculares deben separarse del ADN.

El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de restricción.

Se aísla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida o por centrifugación.

Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores de la expresión génica.


Preparación de un vector de clonación

El vector es elportador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes características:

Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido.

Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que sean conocidos.

Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.

Replicarse de forma independiente al ADN de la célulaanfitriona.

Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibiótico.
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Las etapas del proceso consisten en:

Cortar el vector con enzimas de restricción, las mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN que se quiere insertar.

Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediantelos llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.

Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o simplemente, inserto.

Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos, virus como el fago l, cromosomas creados de forma artificial y quimeras.




Formación del ADN recombinante

En esta etapa se produce la unión covalente delvector y el ADN inserto mediante una ligasa. Así se realiza el sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick.



Introducción del ADN recombinante en la célula anfitriona

Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona.

Los tipos de células anfitrionas son:

Células bacterianas:son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables.

Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales:

Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la...
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