Bioquimica Enzimologia

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son los catalizadores de las reacciones de los sistemas biológicos. Tienen un extraordinario poder catalítico, a menudo muy superior al de los catalizadores sintéticos o inorgánicos. Poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran tremendamente reacciones químicas y funcionan en soluciones acuosas en condiciones muy suaves de temperaturas ypH. Hay pocos catalizadores no biológicos que tengan todas estas propiedades. Actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas mediante las que se degradan nutrientes, se conserva y se transforma la energía química y se fabrican las macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos. A través de la acción de las enzimas reguladoras las rutas metabólicasestán altamente coordinadas, proporcionando una armoniosa influencia reciproca entre la multitud de actividades diferentes que son necesarias para la vida. (Lehninger, 2001)

El rango distintivo de una reacción catalizada enzimáticamente es que tiene lugar dentro de los confines de una bolsa de la enzima denominada sitio activo. La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa la enzimase denomina sustrato. La superficie del centro activo de la enzima esta revestida con residuos aminoacidicos cuyos grupos sustituyentes se unen al sustrato y catalizan su transformación química.
La reacción más simple que pueden catalizar las enzimas está representada por la siguiente ecuación:
E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P
En donde E, S Y P representan,enzima, sustrato y producto. ES Y EP son complejos transitorios de la enzima con el sustrato y con el producto, respectivamente. (Lehninger, 2001)
En este laboratorio utilizaremos la fosfatasa acida de germen de trigo la cual cataliza la hidrólisis de fosfatos monoésteres con liberación de fosfato inorgánico, donde se utilizara un sustrato artificial, el p- nitrofenil fosfato. El grado dehidrólisis de este se determinara espectrofometrcamente cuantificando el p-nitrofenol liberado, que en solución alcalina, absorbe fuertemente a 405 nm.
Los objetivos de este practico son; conocer algunos procedimientos clásicos para determinar actividad enzimática, comprobar el efecto de inhibidores sobre los parámetros cinéticos de una enzima, aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivosy no competitivos en la interpretación de los resultados, observar la variación de la concentración de sustrato en el tiempo, determinando la constate de velocidad de primer orden de la reacción catalizada y así ser capaces de expresar gráficamente los resultados, entonces así determinar los parámetros cinéticos de la enzima.



MATERIALES Y METODOLOGÍA
Con una solución de suero fisiológico(40 ml), unos de los integrantes del grupo se realizó un lavado bucal con la solución durante un minuto, para extraer amilasa salival, la cual, fue filtrada en un embudo y algodón, de este modo se separó los residuos de la preparación enzimática. Se prosiguió a llenar 9 tubos, realizando las siguientes actividades:
Actividad A: Efecto de la temperatura sobre la hidrólisis enzimática delalmidón.
Tubos | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
NaCl 0.9% p/v | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 3 ml |
Tampón fosfato pH 7.0 | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
Almidón 1% p/v | 2 ml | 2 ml | 2 ml | 2 ml | 2 ml |
Preparación enzimática | 2 ml | 2 ml | 2 ml | 2 ml | - |
Incubar a : | 0 °C | 100 °C | 25 °C | 37 °C | 37 °C |

* El tubo 1 se incubó en hielo, el tubo 2 se incubó en el baño termorregulador,tubo 3 se incubó a temperatura ambiente, el tubo 4 y 5 se incubaron a baño maría.

* En el tubo 5 se realizó la solución que actuó como control del almidón al agregarle lugol.
Actividad B: Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival.
Tubos | 1 | 2 | 3 | 4 |
NaCl 0.9 % p/v | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
Tampón fosfato (1 ml) | pH 5 | pH 7 | pH 9 | pH 9 |
Almidón 1%...