Bioquimica general

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PRACTICA DE LABORATORIO Nº 2
EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO. CALCULO DEL Km DE LA FOSFATASA ALCALINA

I. INTRODUCCION

Cuando la concentración de la enzima se mantiene constante y se va incrementando la concentración el sustrato, la velocidad de la reacción va disminuyendo llegando un momento en que no hay mas incremento y la velocidad sehace constante.
Michaelis y Menten describieron esto como una transición de la velocidad de una fase dependiente del sustrato a otra que es independiente.
La constante de Michaelis y Menten o Km mide la afinidad de la enzima por el sustrato: cuanto menor es la constante es mayor la afinidad de la enzima por el sustrato.
El propósito del presente experimento, es estudiar lainfluencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática, para lo cual se utilizara la enzima fosfatasa alcalina hepática de Oryctolagus caniculus “conejo” y, como sustrato, p-nitrofenilfosfato.

II. MATERIALES

1. Material Biológico: Enzima fosfatasa alcalina.

2. Material y Equipo de Laboratorio:

* Gradillas para tubos.
* Tubos de ensayo de 16x 125 mm (08)
* Pipetas de 1 ml, 1 ml al 1/100, 2 ml, y 10 ml.
* Baño María a 37°C.
* Pizeta con agua destilada.
* Espectrofotómetro (440 nm) o Fotocolorímetro.

3. Reactivos:

* Buffer alcalino pH 10.5: Glicina (7.5 g), cloruro de magnesio (0.095 g), agua destilada (750 mL), hidróxido de sodio 0.1 N (85 mL), agua destilada (c.s.p. 1L)* Sustrato bufferado alcalino 0.012 M: p-nitrofenilfosfato disódico (0.436g), buffer alcalino pH 10.5 (c.s.p. 100mL).
* Solución de hidróxido de sodio 0.02 N.

III. PROCEDIMIENTO

COMPONENTES (mL) YPROCESO | TUBOS DE ENSAYO 1 2 3 4 5 6 7 8 |
Sustrato bufferadoalcalino 0.012 M | ---- 0.02 0.04 0.06 0.1 0.5 1.0 1.0 |
Buffer alcalino pH 10.5 | 1.1 1.08 1.06 1.04 1.0 0.6 0.1 0.2 |
Mezcla e incubar a 37 °C por 5 minutos |
Solucion de enzima | 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 ------ |
Incubar a 37 °C por 30 minutos |
NaOH 0.02 N | 1010 10 10 10 10 10 10 |

IV. RESULTADOS
1. Valoración de la actividad de la Fosfatasa Alcalina.
> Calculo de la Concentración Molar del sustrato (mM):
*Factor de Calibración Promedio (Fx): 0.68 mM/L = V
C1 V1 = C2 V2 C1 = 0.012 M (Cte)
V1 = Volumen tomado para c/tuboC2 = Nueva concentración para c/tubo
V2 = Volumen total (11.2 mL) Cte
* Para el tubo 2: C1 V1 = C2 V2
(0.012)(0.02) = (V2)(11.2)
V2 = 2.143 x 10

Tubos [M] [mM]
1----------- ---------------
2 2.143 x 10 0.214 x 10
3 4.286 x 10 0.429 x 10
4 6.428 x 10 0.643 x 10
5 1.071 x 10 1.071 x 10
6 5.357 x 105.357 x 10
7 1.071 x 10 10.710 x 10

* Cálculo de la actividad enzimática:
* *Factor de Calibración Promedio (Fx): 0.68 mM/L = V
Tubos Lecturas (Abs) Actividad enzimática (mM producto/L)
1 0.00 0.00...
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