Bioquimica

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Curso temporal de la lisis de E. coli en presencia de lisozima

Lisozima humana

http://www.bl.uk/onlinegallery/features/beautifulminds/flemingnobellge.html http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learningcenter/lysing-enzymes.html http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learningcenter/lysing-enzymes.html

Material (Equipo)
• 1 Espectrofotómetro • 3 cubetas para el espectrofotómetro • 3 tubos eppendorf

Método
Para cada grupo tomar 4 ml se cultivo de E. coli y centrifugaren la Centrífuga Clínica durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y resuspender en 20 ml de Buffer de reacción. Cada equipo recibirá 2 ml de esta dilución 1:5 del cultivo bacteriano. Encada una de las 3 cubetas, los equipos colocarán 1 ml de las siguientes muestras: 1. Solución de Reacción (Blanco). 2. Dilución 1:5 de cultivo bacteriano. 3. Dilución 1:5 de cultivobacteriano + 20 μl de Lisozima (equivalente a 250 U). 4. La lectura se realizará en celdas de material plástico

Método
• Ajustar absorbancia a 0 con el blanco, leyendo a 450 nm delongitud de onda. Realizar lecturas de los tubos 2 y 3 cada cinco minutos durante 30 minutos (total de 7 puntos)

Los valores de la m (pendiente) son los que nos interesan. Estosvalores los tomarás como absolutos (sin signo). Cada valor lo multiplicarás por el coeficiente de extinción molar (2.062 mM1cm1 ) X 1cm (grosor del celdilla) x volumen total de cultivo (4mL)entre el factor de dilución (1:5 = 0.2ml). Este valor se multiplica por cada uno de los tiempos ( 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30). Los valores obtenidos corresponderán a la velocidad (Vo)
Ext.coefficient 34420 Abs 0.1% (=1 g/l) 2.062, assuming all pairs of Cys residues form cystines Ext. coefficient 33920 Abs 0.1% (=1 g/l) 2.032, assuming all Cys residues are reduced

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