Bioquimica

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PRÁCTICAS DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA PRÁCTICA Nº 1 – Hidrólisis enzimática de la urea. Inhibición por substrato. Inhibición por sustancia extraña.

1. Introducción
La urea es un compuesto químico cristalino, incoloro, de fórmula CO(NH2)2 y peso molecular 60.06 g/mol, soluble en agua y en alcohol. Se obtiene industrialmente mediante la síntesis de Wöhler. Es el principal producto terminal delmetabolismo de las proteínas en el hombre y en los mamíferos, y es excretada en grandes cantidades por la orina. Para las plantas, la urea es un fertilizante que requiere la presencia de una enzima microbiana, la ureasa, que se encuentra en los tejidos de las hojas. La ureasa produce la hidrólisis de la urea y los productos de la reacción se transforman en aminoácidos y proteínas transportables, ensu mayoría, desde las hojas a otras partes de la planta. De esta forma, el nitrógeno aportado por la urea es aprovechado muy rápidamente por la planta sin que se produzcan pérdidas de energía en elaborar otros productos intermedios. La actividad fotosintética se ve así favorecida.

2. Objetivo de la práctica y procedimiento experimental
Se llevará a cabo la hidrólisis de la urea mediante laenzima ureasa en disolución acuosa, como ejemplo de reacción catalizada por una enzima. Se estudiará la inhibición por sustrato en el sistema urea-ureasa.

2.1 Inhibición por sustrato
La inhibición por sustrato o autoinhibición ocurre a altas concentraciones de sustrato (CA). Estas altas concentraciones inhiben la actividad enzimática, de forma que la ecuación de Michaelis-Menten se modifica a:A ⎯E R ⎯→

rR =

k 3C e 0 C A 2 CM + C A + N ·C A

Estudiaremos el efecto de la concentración de substrato en la velocidad de reacción. Para ello necesitaremos preparar disoluciones de diferentes concentraciones de substrato, a las que añadiremos una cantidad fija de enzima ureasa. La tabla a continuación refleja las disoluciones a preparar al inicio de la práctica: Nº disolución 8 7 6 5 Nºdisolución 4 3 2 1 ml de urea al 8% 10 6 4 2 ml de urea al 1% 6 4 4 2 ml de agua destilada 40 44 46 48 ml de agua destilada 44 46 96 98 Concentración (mmol/l)

Concentración (mmol/l)

En algunas de estas disoluciones (las de menor concentración), el efecto de la autoinhibición será despreciable. En las de mayor concentración, el término N·CA2 influirá significativamente en la velocidad dereacción. Determinaremos experimentalmente velocidades iniciales de reacción para cada una de las disoluciones. El avance de esta reacción puede determinarse teniendo en cuenta que la ureasa actúa sobre el sustrato (urea) descomponiéndola a amoníaco y dióxido de carbono como productos finales. Los iones liberados

PRÁCTICAS DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
de esa forma en la disolución acuosa aumentan suconductividad. La lectura de este parámetro nos dará entonces el grado de avance de la reacción:

XA =

Λt − Λ0 ; Λ∞ − Λ0

C A0 − C A = C R = C A0 ·

Λt − Λ0 Λ∞ − Λ0

Para el desarrollo de la práctica usaremos el dispositivo ChemUnit que mediante medidas de conductividad nos permitirá interpretar fácilmente los datos obtenidos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL - Verter 50 ml de ladisolución nº1 en un vaso de precipitados que colocaremos en la placa agitadora. Introducir el electrodo de medida de conductividad en el vaso. - Añadir 500 μl de la disolución de ureasa con la micropipeta, a la vez que se empieza la toma de medidas en el PC. El transcurso de la reacción puede seguirse en pantalla. - Mantener la medida de conductividad durante 4 minutos, guardar los datos con un nombreapropiado. - Repetir el procedimiento con cada una de las disoluciones restantes.

A partir de estas medidas queremos obtener datos de velocidades iniciales. Para ello podemos identificar la velocidad como la pendiente de la gráfica conductividad-tiempo. En este caso, la velocidad inicial sería la pendiente tomada en los primeros segundos. Sin embargo, no es recomendable tomarla desde el instante...
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