Bioquimica

Estudio Cinético de la
Enzima Alfa-Amilasa

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Introducción

La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren.

La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:

❖ por la cantidad de sustrato quedesaparece en la unidad de tiempo
❖ por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo

En este práctico de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato (S), de la enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética de la enzima alfa-amilasa salival en su acción sobre los enlaces alfa 1-4 del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidónen la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el mismo, así como sus productos de hidrólisis con el yodo en disolución de yoduro de potasio (Reactivo de Lugol).

Objetivos

❖ Estudiar la influencia de la concentración de sustrato (S), de la enzima (E), el ph. y la temperatura en la cinética de la enzima alfa- amilasa salival en su acción sobre los enlacesalfa 1-4 del almidón.

Procedimiento experimental

ACTIVIDAD 1:

Estudio de la influencia de la enzima (E).

Materiales:

❖ 5 tubos de ensayo.
❖ Pizeta.
❖ 3 Pipeta.
❖ 1 Propipeta.
❖ 1 placa de petri.
❖ Pipeta Pasteur.

Reactivos:

❖ Solución de la enzima: Se prepara recolectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) ydiluyéndolo hasta 20 ml con agua destilada.
❖ Solución de almidón al 0,5 %.
❖ Solución de Lugol: Se prepara disolviendo 1g de yodo, 2g de KI en 200 ml de agua destilada.
❖ Soluciones tampón de pH 5,0; 6,8 y 8,0.

Procedimiento:

❖ Tomar 4 tubos de ensayo y añadir a cada uno 2 ml de solución de almidón al 0,5%.

❖ Añadir a cada tubo 0,1; 0,2; 0,3 y 0,4 ml de solución de laenzima, y completar hasta un volumen de 0,5 ml con agua. Añadir primero el agua y luego la solución de la enzima, pues de lo contrario la reacción comenzará a verificarse y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución de la enzima al último tubo ponga en marcha el cronómetro y comience a medir el tiempo del experimento.

❖ En cada intervalode 1 minuto ensayar en la placa la reacción de la solución experimental con el lugol: para ello sólo tiene que extraer con un gotario pequeñas cantidades de cada tubo de ensayo en reacción a la placa y luego adicionar una gota del reactivo de lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados.

❖ Determinar por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de lostubos en no dar reacción alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en la placa unas gotas de agua y lugol para tenerlo como solución de control.

Resultados

|Tubos |1 |2 |3 |4|
|Volumen de enzima (ml) |0,1 |0,2 |0,3 |0,4 |
|Tiempo total de reacción (min) |24 min |9 min |6 min |5 min |
|Velocidad de la reacción (1/t) |6,94 x 10-8|3,70 x 10 -7 |8.3 x 10-7 |1,3 x 10-6 |

Discusión:

A mayor cantidad de enzima, mayor catálisis de sustrato, por lo tanto la concertación de enzimas es proporcional a la velocidad de reacción.

Actividad Nº 2

Estudio de la influencia del pH.

Materiales:

❖ 3 Pipeta.
❖ 1 propipeta.
❖ 3 tubos de ensayo....