Bioquimica

Páginas: 10 (2335 palabras) Publicado: 19 de diciembre de 2012
1. RESUMEN

En este informe se describe la purificación para la lisozima de clara de huevo de gallina. En esta purificación se realiza un tratamiento ácido, un tratamiento térmico y dos cromatografías ( una de intercambio iónico y otra de penetrabilidad). Se mide la actividad enzimática, y con una tabla de purificación comparamos las distintas etapas de la purificación. También se realiza unaelectroforesis en presencia de SDS para analizar la purificación.

2.INTRODUCCIÓN

La lisozima o muramidasa, también llamada péptidoglicano N-acetil-muramil hidrolasa o EC 3.2.1.17, es un conjunto de componentes de un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos beta (1-4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana. Esto es posible gracias a que posee unaactividad beta (1-4) glucosaminidasa sobre polímeros de N-acetilglucosamina (NAG) y N-acetil-murámico (NAM) , que junto a otros componentes polipeptídicos forman la estructura tridimensional de las paredes bacterianas. Su fenómeno bacteriológico fue descrito en 1992 por Fleming (1).

La localización de esta enzima se da en secreciones humanas ( lagrimas, saliva, mucus nasal, mucus bronquial,mucus cervical, sudor y plasma sanguíneo) y en otros vertebrado, invertebrado, bacterias, virus y plantas. La primera enzima que fue secuenciada fue la lisozima, también fue la primera de la que se dispuso su modelo tridimensional, y la primera para la que se dispuso un mecanismo catalítico detallado (2).

La distintas lisozimas se diferencian en su estructura primaria, aunque todas songlobulares y tienen una sola cadena polipeptídica, y al mismo tiempo poseen características comunes:
son proteínas básicas ( pI=10,5-11,0)
masa molecular baja (14000-30000 Da)
son estables a pH ácido
presentan actividad lítica frente a Micrococcus lysodeikticus (bacteria Grampositiva)

Las etapas en esta practica serán:
Elección del material biológico: la lisozima de la clara dehuevo de gallina.
Selección del medio se suspensión
Ruptura del material biológico: homogeneización.
Fraccionamiento del extracto crudo: cromatografía de penetrabilidad (basada en diferencias de tamaño), cromatografía de intercambio iónico (basada en diferencias de carga) y electroforesis (basada en diferencia de tamaño).
Técnicas analíticas: para cuantificar la purificación, medimosla actividad enzimática mediante un ensayo enzimático y mediante un ensayo colorimétrico.

Referencias:
- 1. Fleming A. & Allison V.D. (1992). Observations on a bacteriolytic substance (lysozyme) found in secretions and tissues. Br J Exp Pathol 13, 252-260.
- 2.Vocadlo D.J., Davies G.J., Laine R. &Withers S.G. (2001). Catalysis by hen egg.white lysozyme proceeds via acovalente intermediate. Nature 412, 835-838.


3. OBJETIVO

El objetivo es proponer un método para la purificación de la enzima lisozima de clara de huevo de gallina. Tras purificar la proteína, determinamos su actividad y la cantidad de proteína presente en las diferentes fracciones para conocer el grado de purificación y la recuperación de la enzima a lo largo del proceso. Realizamos lapurificación con distintos métodos para purificar con el fin de compararlos y elegir el más adecuado para próximas purificaciones. También, se realizará una electroforesis,y una vez recogidos todos los datos, se propondrá un método de purificación con mejoras.

4. MATERIALES Y METODOS

Los reactivos que usaremos en la practica son: 1L de ácido acético 0,1M ; 100ml de tampón fosfato potásico 0,6MpH 6,6 ; 250 ml de tampón fosfato 0,1M pH 6,6 ; 100ml de tampón fosfato potásico 1M pH 7,0 ; Sephadex G-75 ; Amberlita CG-50 ; Reactivo de Bradford ; BSA 1mg/ml ; paredes de Micrococcus lysodeikticus 0,3 mg/ml en tampón fosfato 0,1M pH 6,6. De aparatos son necesario: espectrofotometro ; colorimetro ; centrifuga ; balanza analítica ; pHmetro ; vortex.

El esquema de aislamiento consta de: un...
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