Ciencia microbiologia

PRACTICA N° 14
SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS
I. OBJETIVOS

i) Evaluar el efecto antimicrobiano – antimicótico in vitro de diferentes antibióticos, plantas medicinales; frente a bacterias y hongos.

II. INTRODUCCIÓN
Los recursos en plantas con propiedades curativas son inmensos, y un mejor conocimiento de ellas y sus propiedades farmacológicas, podrían permitir una nueva políticaen salud.
Hacia finales de los años 50, las determinaciones de susceptibilidad a los antimicrobianos eran un caos, debido a que no existía un procedimiento estandarizado aceptable. La Organización Mundial de la Salud conformó un comité cuyas deliberaciones proporcionaron los principios fundamentales que condujeron al desarrollo de las técnicas estándares de Anderson primero y de Kirby-Bauerdespués.
La técnica de difusión en disco aporta datos cualitativos o semicuantitativos acerca de la sensibilidad de un microorganismo particular a un antibiótico preciso.
El método de Kilby-Bauer, es una técnica sencilla donde se ensayaban diferentes dosis de antibióticos sobre diferentes microorganismos y se observa la presencia o ausencia de los halos de inhibición.

III. PARTE EXPERIMENTAL* MATERIALES

* Asa de inoculación.
* Vernier o regla graduada en mm.
* Pinzas estériles.
* Placas Petri.
* Matraz de Erlenmeyer de 250 cc y 500 cc.
* Probetas.
* Hisopos estériles.
* Tubos de ensayo estériles con tapa rosca.
* Gradillas para tubos de ensayo.
* Pipetas.
* Micropipetas.
* Tips descartables.
* Plumón marcador.
* Papelkraf.
* Papel de aluminio.
* Guantes.
* Mascarilla.
* Cepas de cultivo.

* Medios de cultivo y reactivos

* Caldo triptosa fosfato, soya tripticasa o Mueller-Hinton.
* Caldo peptona.
* Agar tripticasa de soya.
* Agar Saboraud dextrosa.
* Agar Mueller-Hinton.
* Solución salina 0.9% estéril.
* Disco de sensibilidad de Amikacina 30ug.
* Disco desensibilidad de Ampicilina 10ug.
* Disco de sensibilidad de Gentamicina 10ug.
* Disco de sensibilidad de Griseofulvina.
* Disco de sensibilidad de Nistadina.
* Disco de sensibilidad de Norfloxacino 10ug.
* Disco de sensibilidad de Nitrofurantoina 300ug.
* Disco de sensibilidad de tretaciclicina 30ug.
* Disco estériles de 6mm de diámetro.

* Equipos

* Mechero deBunsen.
* Potenciómetro.
* Estufa de cultivo a 35°C.
* Baño maría regulado a 35°C.
* Refrigerador de 2-8 °C.
* Autoclave.
* Cámara de flujo laminar.
* Espectrofotómetro o fotocolorímetro.
* Vortex (agitador electromagnético)
* Balanza analítica.

* METODOS

* Método de Disco Difusión según Kirby-Bauer

* Preparación de la Muestra y Discos:
*Preparar una solución Stock de 500 mg/ml de cada sustancia a evaluar, a partir de la cual se realizarán diluciones sucesivas para obtener las concentraciones a usar en la prueba.
* Impregnar los discos de papel de filtro (6mm) de diámetro con 25 µl de la solución y secar a temperatura ambiente.

* Purificación de cepas:
* Bacterias: para la activación de los microorganismos las cepasse repicarán en Agar Tripticasa de soya por el método de inoculación por estrías, y luego sembradas en sus diferentes medios específicos, incubar las placas a 37°C por 24 horas.
* Hongos y levaduras: las cepas se repicarán en Agar dextrosa 4% saboraud por el método de inoculación por estrías. Incubar las placas a temperatura ambiente por 7 días.

* Inoculación

a. preparación delinoculo:
Se utilizara el método de crecimiento
* De las placas con el agar, se selecciona 3 colonias aisladas de apariencia similar
* Incubar el caldo a 35 o 37 °C, hasta que alcance su turbidez
* Ajustar la turbidez del inoculo con la solución salina o caldo apropiado.

b. Inoculación de las placas
* Después de ajustar la turbidez del inoculo, sumergir un hisopo estéril...