Cinética de producción de enzimas por hongos ligninolíticos


CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA
USO DE ENZIMAS EN BIORREMEDIACIÓN


PRACTICA # 3


CINETICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS EN Bjerkandera adusta,
Trametes versicolor y Sporotrichum pulverulentum.



INGENIERÍA BIOQUÍMICA

7º semestre
19/10/12

PRÁCTICA No. 3
CINÉTICA DE PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS EN Bjerkandera adusta,Trametes versicolor y Sporotrichum pulverulentum.



OBJETIVO.
Obtener una cinética de producción de las enzimas ligninolíticas lacasa, ligninoperoxidasa y manganeso peroxidasa en un medio inductor de enzimas.

INTRODUCCIÓN.
Los hongos de podredumbre blanca de la madera tienen la capacidad de producir un complejo enzimático con actividad oxidativa contra una amplia variedad de sustanciastóxicas recalcitrantes como plaguicidas, tintes, hidrocarburos poliaromáticos, explosivos, etc., que contaminan suelos y cuerpos de agua. (Hammel, 1996)

Su propagación sobre suelos contaminados, la producción de enzimas ligninolíticas y la biodegradación de contaminantes, se favorece cuando estos hongos se inoculan en el suelo mezclados con materiales lignocelulósicos que les suministran lafuente de carbono necesaria para sostener su crecimiento e inducir la producción del complejo enzimático. Este trabajo muestra la capacidad para producir las enzimas ligninolíticas: lacasa, manganeso peroxidasa (MnP) y ligninoperoxidasa (LiP) en cultivo hongo Bjerkandera adusta. (Hammel, 1996)

La lignina es un biopolímero aromático complejo; es el segundo polímero en abundancia después de lacelulosa, constituye cerca del 15% de la biomasa terrestre y su fuente natural es la madera, donde se encuentra en una proporción del 20 al 35%. Solamente un pequeño número de microorganismos son responsables de la biodegradación de la lignina, de los cuales los hongos de la podredumbre blanca constituyen el grupo más importante, gracias a que producen unas enzimas ligninolíticas extracelulares,ligninoperoxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa(MnP), que tienen una potente capacidad oxidante. (Hammel, 1996)

En la degradación enzimática de la lignina intervienen una serie de reacciones inespecíficas que originan la formación de radicales libres en el biopolímero y dan como resultado la desestabilización de los enlaces y finalmente la ruptura de la macromolécula. (Barr, et al. 1994)

Loshongos de la podredumbre blanca de la madera, también llamados hongos ligninolíticos, así como sus enzimas ligninolíticas, tienen potencial aplicación en la industria del papel, principalmente en el proceso de deslignificación durante el blanqueo, y en biorremediación de suelos y aguas contaminadas, porque la baja especificidad de estas enzimas les permite oxidar, además de la lignina, una ampliavariedad de compuestos orgánicos contaminantes como tintes, hidrocarburos poliaromáticos, pentaclorofenol, etc. (Bumpus, 1985)


MATERIAL, REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO.

Material

Espectrofotómetro y celdillas de 1cm
2 gradillas
Micropipetas de 1000 µl y 200 µl
Agitador orbital
Parafilm, papel secante
Puntas para micropipeta (1000 µl y 200 µl)
40 puntas azules (1000 L despuntadasestériles o 20 pipetas graduadas despuntadas estériles)
80 tubos eppendorf de 2ml estériles
1 hoja de bisturí con mango
1 frasco de Gerber con agua estéril
1 blender (homogenizador)
1 recipiente de acero inoxidable p/homogenizador
1 mechero Fischer
1 balanza analítica
2 microespátulas estériles

Reactivos y material biológico.

Cepa de B.adusta, T. versicolor y S. pulverulentum en PDA.250ml de Buffer de acetatos 100mM pH=5
100ml de solución de siringaldazina 0.8mM en metanol.
Buffer de succinatos 40 mM pH=4.0
Alcohol veratrílico 40mM
Solución de peróxido de hidrógeno 0.03%
Buffer de malonatos 50mM pH=4.5 con sulfato manganoso 1mM.
Solución de peróxido de hidrógeno 0.01%
100ml de medio líquido GMY estéril que contiene: Glucosa 10g/l, extracto de malta 3.5g/l, extracto de...