Citometria de fluorescencia

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CITOMETRIA DE FLUORESCENCIA

Las técnicas citométricas de inmunofluorescencia se basan en la detección de antígenos (Ag) presentes en la membrana de las células en suspensión . Para ello se aprovecha la existencia de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer Ag de membrana que permiten.

← Reconocer una población celular.
← Identificar las células efectoras de una determinada función.← Estudiar el grado de activación de una población celular.

La citometria de flujo es una técnica de análisis celular multiparametrico  cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas  (células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado.
La citometría de flujo es un proceso que permite la medida simultánea de múltiples características físicas deuna sola célula. Estas medidas son realizadas mientras las células pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido

La REALIZACIÓN DE CITOMETRIA DE FLUJO Se hace en 3 etapas:
← Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del protocolo y coloración de las células con losreactivos fluorescentes.
← Fase de citometría de flujo : involucra el procesamiento de las células marcadas y la recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) realizados en cada célula individual.
← Fase de análisis: análisis de los datos recolectados
La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a través de una aguja creando una delgadafila de líquido que contiene las células. A medida que cada célula pasa en frente del láser, desvía el rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera dehistogramas o "dot-plots" .
APLICAcIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
← Hematología : tipificacion y conteo de células , reticulocitos y análisis de medula ósea .
← Farmacología :estudios de cinética celular
← Inmunología :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular
← Oncología :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos
← Microbiología :diagnostico bacteriano yvirico ,estudios de sensibilidad a los antibióticos
← Genética : Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Es una prueba de diagnóstico serológico que tiene dos variedades principales:

a) Inmunofluorescencia directa (IF) aplicada fundamentalmente a la detección de antígenos en una muestra clínica

b) Inmunofluorescencia indirecta (IFI)aplicada a la detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente frente a un determinado antígeno o a la detección de un antígeno en una muestra clínica.

En la Inmunofluorescencia directa, sobre un porta depositamos una muestra en la que buscamos la presencia de un determinado antígeno. Añadimos un suero específico del antígeno problema marcado con isotiocinato de fluoresceína(conjugado). Si el antígeno problema se encuentra presente en la muestra, se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se elimina con un lavado del porta.

La inmunofluorescencia directa es el método de elección para el fenotipaje celular por citometría de flujo, ya que presenta destacadas ventajas frente al marcaje indirecto: gran rapidez de ejecución (sólo requiere una incubación) y laposibilidad de efectuar marcaje múltiple con facilidad.

La técnica consiste en incubar la sangre con anticuerpos monoclonales previamente marcados con: isotianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (RD1) u otros fluorocromos; así los antígenos monoclonales se unen específicamente a determinantes antigénicos presentes en la superficie celular.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

En estas técnicas...
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