Criopreservacion

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Criopreservación de células

Introducción
Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente células en los laboratorios son: que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y por último, que estas células permanezcangenéticamente estables. El método de conservación más usado es la congelación (criopreservacion), durante la criopreservación se paraliza el crecimiento de las células, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas.

Dado que las características de un material biológico varían en función de su origen y estado dediferenciación, cada protocolo de criopreservación debe establecerse empíricamente. Un protocolo de criopreservación implica la exposición y equilibrio del material biológico a agentes crioprotectores, el enfriamiento y almacenamiento a temperaturas bajo cero, el descongelamiento y la dilución o eliminación del agente crioprotector. Además, debe contarse con ensayos funcionales que permitan evaluar, tantoin vitro como in vivo, el material biológico en cada etapa.

Almacenamiento: temperaturas de almacenamiento lo suficientemente bajas, no alterarán la sobrevida celular aún en periodos de tiempo muy prolongados. A temperaturas superiores a –80°C las células pierden viabilidad gradualmente, lo que no sucede a temperaturas menores a -130°C; ya que bajo esta temperatura el agua existe sólo en suestado cristalino y no hay suficiente energía para que ocurran las reacciones bioquímicas propias de los sistemas biológicos. Por lo tanto, usualmente el almacenamiento se hace a –196°C, temperatura del nitrógeno líquido (N2L) o a -80°C, temperatura de freezer.

Congelamiento y Descongelamiento: Los periodos de mayor peligro potencial que comprometen la sobrevida celular son la fase inicial deenfriamiento y el retorno a la temperatura fisiológica. Los factores responsables de daños celulares son:
A. Formación de cristales de hielo intracelular: la formación de cristales de hielo durante el congelamiento y el crecimiento de ellos durante el descongelamiento dañan las membranas biológicas. El grado de daño celular está determinado más por la cantidad de cristales dentro de cada célulaque por el tamaño individual de ellos. En células enfriadas rápidamente los cristales son pequeños, pero si la descongelación es lenta, ellos tienden a agregarse dada su alta energía de superficie. En cambio, si la descongelación es rápida no habrá tiempo suficiente para que antes de alcanzar la temperatura de fusión del agua, la cantidad de cristales formados alcance una cantidad letal.
B.Efecto de soluto: el congelamiento produce un incremento dramático y progresivo de la concentración de solutos en los líquidos residuales no congelados. Por ejemplo, cuando una solución se congela a – 10°C se produce un incremento de más de 20 veces en la concentración de electrolitos. El aumento de las concentraciones intra y extracelulares de electrolitos desestabiliza las membranas celulares.C. Aumento de la temperatura durante el cambio de fase: el cambio energético asociado a la transición de liquido a sólido se traduce en un aumento de la temperatura, que per se modifica la congelación de la muestra comprometiendo la sobrevida celular. La alternativa para compensar este aumento de temperatura es utilizar crioprogramadores que permitan un mayor enfriamiento mientras ocurre el cambiode fase.

Eventos que ocurren durante el congelamiento y descongelamiento: cuando una célula se enfría entre -5 y -15°C, el hielo se forma primero en el medio extracelular. El citoplasma se súper enfría, así el potencial químico del agua es más alto en el exterior. Ya que la membrana plasmática es permeable al agua pero no al hielo, el agua pasa desde el intracelular (alto potencial químico)...
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