Cristalización de proteinas

Protocolo
Un punto importante en el área de la biología estructural y funcional de la membrana biológica (Figura 1). La membrana que rodea las células y orgánulos subcelulares cuando está presente, es una estructura molecular fina sólo dos moléculas de lípidos en todo y está repleta de proteínas. Estructura y la función que se aplican tanto a los lípidos y las proteínas son de interés. Sinembargo, el foco de este artículo se limita a las proteínas de membrana.
Una mejor comprensión de cómo las proteínas de membrana de función a nivel molecular se busca por dos razones. En primer lugar, está la satisfacción intelectual de saber cómo funcionan. En segundo lugar, por saber cómo funciona una proteína, siempre existe la posibilidad de ser capaz de arreglar lo que funciona mal o de mejorar oincluso modificarlo para aplicaciones particulares. El diseño de fármacos es un resultado obvio de este tipo de trabajo. Un método para averiguar cómo una proteína de membrana trabaja a nivel molecular para determinar su estructura. Esto implica establecer el lugar en el espacio de 3 dimensiones de todos los átomos, o por lo menos todos los átomos no hidrógeno, que forman la proteína. El métodoque usamos para este propósito es macromoleculares cristalografía de rayos X (MX). La figura 2 muestra un ejemplo de una proteína de membrana cuya estructura se determinó a través MX. Un cristal de la calidad de la difracción de la proteína es necesaria para hacer MX.
Está claro que hay muchos pasos implicados en la determinación de la estructura utilizando cristalografía macromolecular. Esto seilustra en la Figura 3. Por lo general, estos incluyen la identificación de un objetivo de proteína de la membrana, y luego la producción, purificación y cristalización del mismo. Medidas de difracción se llevan a cabo en el cristal con una casa o una fuente de sincrotrón de rayos-X. Los datos de difracción se procesan produciendo un mapa de densidad de electrones que se ajusta entonces con unmodelo molecular. El modelo, al refinado, puede ser utilizado para explorar el mecanismo de acción de la proteína y de la estructura basada en el diseño de fármacos.
El enfoque de este artículo es mostrar cómo producir cristales de difracción de la calidad de las proteínas de la membrana lipídica con mesofases, por el llamado método de meso. Una reciente revisión del método y su alcance estádisponible en la Referencia 1 (Caffrey, 2009). El protocolo de paso a paso vamos a seguir aquí se describe en la Referencia 2 (Caffrey y Cherezov, 2009).
Un diagrama de flujo que resume los pasos a seguir y el tiempo requerido para establecer un juicio en el meso cristalización de proteínas de membrana se muestra en la Figura 4. Este artículo cubre los pasos cerrados por líneas discontinuas de color rojo.Parte 1: Preparación de las placas de cristalización
1. Posición de un portaobjetos de microscopio silanizada en el banco de trabajo.
2. Quite la cubierta del papel de protección de una superficie de una tira de cinta perforada de doble barra espaciador (disponible en el mercado, véase el cuadro de los reactivos y equipos específicos más adelante).
3. Coloque la cinta, el ladopegajoso hacia abajo, en contacto con la superficie de la diapositiva.
4. La presión de sellado de la cinta a la diapositiva con un rodillo o rodillo. Papel de aluminio se pueden colocar entre la cinta y el rodillo para proteger la base de los pozos.
5. Quite la cubierta del papel de la segunda cinta para exponer la superficie adhesiva superior.
6. Lugar individual cubreobjetos silanizada enlas proximidades de la placa de sellado rápido y eficiente de los pozos tan pronto como se termine la carga.
Parte 2: Preparación de la jeringa de lípidos
1. Lugar de los lípidos (a menudo monoolein) en un bloque de temperatura controlada a 45 ° C durante 3 minutos para que sea fundido.
2. Mientras que los lípidos se está derritiendo preparar dos de 100 l Jeringas de gas Hamilton para...