Cromatografía de exclusión por tamaños

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR
TAMAÑOS (SEC: size exclusión cromatography)

La cromatografía de exclusión por tamaños está basada en la utilización de fases estacionarias constituidas por una material, principalmente orgánico, muy poroso y teóricamente inerte que permite la discriminación de los solutos según su forma o tamaño molecular. Es muy difícil conocer la forma de los solutos endisolución, por lo que principalmente se utiliza el diferente tamaño (peso molecular) para realizar la separación.

Un material muy poroso es aquél en el que el volumen del material es despreciable frente al volumen de los poros.

La IUPAC divide a la SEC en dos modalidades en función de la solubilidad de las sustancias a separar, aunque es una división en desuso.

-Cromatografía de filtración en gel (GFC). Para sustancias solubles en agua.

- Cromatografía de penetración en gel (GPC). Para sustancias lipofílicas.

CAMPO DE APLICACIÓN

El campo de aplicación de esta técnica es muy amplio, aplicable a todo tipo de moléculas ya que el tamaño de poro, fundamental en el proceso de separación, es controlable y realizable en cualquier medida. Sin embargo, seaplica únicamente a macromoléculas, es decir, aquellas moléculas con un peso molecular superior a 2000 Da, ya que para moléculas más pequeñas se utilizan técnicas como las anteriores.
El tamaño está limitado hasta 107 Da, límite impuesto por el tamaño de poro.

La SEC es una técnica imprescindible para la caracterización de polímeros sintéticos, ya que las propiedades técnicas de éstosdependerán de su polidispersidad o distribución de pesos moleculares (un plástico polidisperso es de baja calidad). Es una técnica de gran aplicación en bioquímica, útil para el análisis de macromoléculas naturales solubles en agua, como polisacáridos o proteínas, aunque para estos casos se suele utilizar la electroforésis.

MECANISMO DE SEPARACIÓN

Tenemos una columna constituida por una faseestacionaria de tamaño de partículas de 3 a 5 micras y totalmente porosas. Para el estudio de la separación inyectamos en un flujo de velocidad constante dos tipos de moléculas de determinado tamaño, unas de menor tamaño que el diámetro del poro (A) y otras de mayor tamaño que el diámetro del poro (B).

1. El distinto tamaño de las moléculas hace que unas recorran más camino que otras. Lasmás pequeñas entran en el entramado poroso de las partículas de la fase estacionaria, mientras que las más grandes no entran, avanzan en la columna a través de los espacios intersticiales (espacios entre partículas), por lo que recorrerán menos camino.

2. Todas aquellas partículas de mayor tamaño que el de los poros salen a la vez creando el primer pico cromatográfico. Este pico defineexclusión total, ninguna de las moléculas correspondientes a este pico se introduce en el entramado poroso. Este pico nos define el volumen vacío intersticial (Vo), es decir, el volumen de la fase móvil de los intersticios.

3. Aquellas moléculas que se introducen en los entramados porosos tardan más en salir, tardando más cuanto más pequeñas sean. Suponemos que se trata de moléculas no mucho máspequeñas que el tamaño de poro, suponemos penetración parcial.

4. Este último pico se debe a las moléculas de disolvente, ya que son las más pequeñas y por tanto las que más tardan en salir. Es el pico de inyección y nos define la penetración total y el volumen total (VT = intersticios + poros).

Todas aquellas sustancias que eluyan en Vo o en Vt (límites cromatográficos) no podránsepararse con este tamaño de poro.

RANGO DE PERMEACIÓN

Para determinar el rango de pesos moleculares que pueden separarse en función de la porosidad de la fase estacionaria se construye una curva de calibrado utilizando patrones de las macromoléculas a separar. Lo más habitual es representar el log Pm en función del volumen de retención (VR).

La curva obtenida presenta una parte...
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