Cromatografia interaccion hidrofobica

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  • Publicado : 2 de junio de 2011
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Introducción

La proteína GFP es una proteína fluorescente cuando es expuesta a la luz ultravioleta en donde mediante resonancia libera energía en forma de luz verde.(1) Después del proceso de clonación realizado en el practico anterior se procede a continuar con la purificación de la proteína GFP de otros componentes intracelulares.
El proceso de inoculación o crecimiento bacterial se realizacultivando colonias de la bacteria transformada en condiciones propias en medio de cultivo líquido con LB/amp/ara ideal para su aislamiento para luego mediante un proceso de centrifugación se debe concentrar en un espacio especifico.(2)
El proceso de lisis o rompimiento celular es la rotura de la membrana celular (membrana hecha de fosfolípidos) que separan el contenido celular del ambienteextracelular. Entre algunos ejemplos de mecanismos que provocan lisis están:
* Homogeneización líquida. Las células se rompen al ser forzadas a pasar por espacios muy pequeños.
* Stress mecánico: Uso de trituradores que imitan acción de un mortero.
* Sonificación. Ondas de alta frecuencia rompen las células.
* Uso de una enzima: Lizosima es una enzima que rompe las cadenas depolisacáridos de la pared celular.
* Congelamiento. Ciclos de congelación continuos que rompen la pared celular.
*Estos 2 últimos serán utilizados en este práctico.(3)
Es importante eliminar los restos celulares y también aquellas células que no hayan sido lisadas en el proceso de lisis. Para esto se utiliza la centrifugación la cual es una  técnica que se utiliza para separar moléculasen base a su tamaño con al alta velocidad.
Por último se debe separar la proteína a estudiar (en este caso GFP) mediante un proceso llamado cromatografía, siendo esta un método de purificación que se utiliza para la separación de proteínas de otras moléculas. Para esto se utiliza una característica especifica de GFP la cual es contener gran cantidad de residuos hidrofóbicos y por ende ser mashidrofóbica que el contenido restante intracelular. Es por esto que se utilizarán columnas cromatográficas de interacción hidrofóbica la cual será ideal para separar la proteína GFP.(1)
Para identificar la presencia de la proteína que se requiere estudiar (GFP) se utiliza la técnica de tinción, la cual permite teñir proteínas en geles de policriamidas. Los colorantes que se pueden utilizar son RojoPonceau, Tinta China o Negro Amido. El rojo Ponceau es un colorante que se emplea en medio acuoso, la tinción que se efectúa con este colorante es rápida pero no es permanente y puede desaparecer en el procesamiento posterior. (2)


Objetivos

1. Obtener GFP de manera pura o aislada a través de los métodos de:
* Crecimiento o amplificacióncelular
* Concentración celular
* Rompimiento celular
* Separación o purificación de la proteína
2. Realizar un Blotting de Proteinas a través de la Técnica de Dot Blot con rojo de Ponceau.

Materiales y métodos:

Concentración celular
Primero se procedió a tomar una alícuota de 1,5 mL que estaba previamente en un tubo con una pipeta estéril y luego sevierte en un microtubo con el cultivo LB/AMPARA/DNA +. Luego toda esta mezcla se lleva a centrifugar por 5 minutos a velocidad máxima. Luego se voltea el microtubo con el cultivo para eliminar de esta manera el sobrenadante ya que este queda alojado en el fondo del microtubo y se arroja sobre un tubo de ensayo que servirá para los desechos y luego se procede a observar con la luz ultravioleta elprecipitado con las proteínas. Posteriormente se procede a agregar con una pipeta 250 ul de solución TE en el microtubo y se resuspende el precipitado pipeteando el precipitado rápidamente hacia arriba y abajo varias veces

Lisis celular
Al microtubo que contiene la proteína se le agrega con una micropipeta 10 ul de lisozima y se llevo a una incubadora a una temperatura de 37°C, luego con...
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