Cromatografia intercambio

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Cromatografía de intercambio iónico

1-Preparando el gel

1. Equilibrar todo el material a temperatura ambiente
2. Sepharosa fast flow esta preservado con etanol al 20%. Decante el etanol y reemplácelo por el buffer de empaque a un volumen total de 32.5 ml (75% del gel seleccionado y 25% de buffer)
3. Desgasificar la mezcla por vacío

2- Armanado la columna

1. Revisarque las partes estén limpias e intactas
2. Conectar la pieza inferior a una bomba o jeringa. Sumergir el extremo en el buffer y llenar la pieza con la bomba o jeringa. Asegúrese que no tenga burbujas de aire debajo de la red. Cerrar la tubuladura con un stopper
3. Conectar la pieza inferior a la columna de vidrio y llenar con unos mililitros de buffer para que el final de la columnaquede cargado

3-Empacando la columna

Las instrucciones que a continuación se detallan son para empacar una columna XK/16 con Sepharosa Fast Flow ion exchange media. Para modificar estas instrucciones para columnas de diferentes dimensiones, refiérase al apéndice A
1. Introduzca la mezcla de gel dentro de la columna en un solo paso continuo para ayudar a prevenir la introducción deburbujas. Llenar el remanente da la columna con buffer.
2. Repetir el paso 2.2 con el extremo adaptador de la columna. Asegúrese que todas las burbujas hayan sido retiradas. Desconecte la bomba. Inserte el adaptador en la bomba en ángulo, teniendo cuidado de que no quede aire en la red. Ajustar el O ring del adaptador para que se deslice sobre las paredes de la columna.
3. Asegurarse que noqueden burbujas en las tabuladuras e insertar el adaptador hasta alcanzar el tope del gel. Ajustar el o-ring y trabar el adaptador
4. Retirar el stopper de la parte inferior de la columna y encender la bomba. Empaque el gel a una tas de flujo de 12/14 ml/min. Empaque a este flujo constante hasta que la altura del gel sea constante(aprox. 4-5 minutos)
Nota: Idealmente, Fast Flow media seempaca una presión constante de 2 pascales, para una columna de 16 mm de diámetro.
5. Detenga la bomba, cierre la parte inferior de la columna, aflojar el o-ring del adaptador para permitir el deslizamiento y el reposicionamiento del adaptador sobre el lecho del gel. Presione el adaptador sobre la superficie del gel y adiciónele 1-2 mm. Trabe el adaptador en esa posición, quite el stopper de lapieza inferior de la columna y encienda la bomba al flujo de empaque de columna.
Si el lecho sigue empacándose repita el paso 5. Cuando el lecho del gel es estable, la columna esta empacada, equilibrada y lista para usar. Si lo desea, la calidad del empaque puede ser chequeada usando el procedimiento de testeo descripto en el apéndice B.

4- Equilibración

Para equilibrar, bombeeaprox. 100 ml del buffer inicial a un flujo de 8-10 ml/min. La columna esta totalmente equilibrada cuando el pH o la conductividad del eluido es el mismo que el del buffer inicial.

5- Preparación de la muestra

La cantidad de muestra que puede ser aplicada va a depender de la capacidad de intercambio y del grado de resolución requerido. Para una mejor resolución, usualmente no hay queexceder el 10% o 20% de la capacidad de la columna. Refiérase a la tabla 1 del apéndice C para obtener una guia de capacidades de columna
La muestra debe disolverse en el buffer inicial. Alternativamente la muestra podría pasarse al buffer inicial por diálisis o filtración en gel. La viscosidad de la muestra no debe exceder la el buffer inicial. Para un sistema de buffer acuoso esto correspondea una cantidad de proteínas de aprox. 50mg/ml
Antes de la aplicación la muestra debe ser filtrada por 0.45um.

6- Tasa de flujo de operación

El flujo usado para el pegado de la muestra y la subsecuente elusión va a depender del grado de resolución requerido, pero normalmente esta dentro de los 10-15 ml/min (300-450 cm/h). Cuanto menor sea el flujo mayor será la resolución....
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