Cuantificacion

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  • Publicado : 31 de mayo de 2011
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Objetivos:

• Realizar una simulación de purificación de proteínas para familiarizarse con las distintas técnicas de purificación y análisis de proteínas.
• Adquirir destreza en el manejo delos parámetros que se utilizan para analizar las sucesivas etapas de purificación (rendimiento, grado de purificación y actividad específica).
• Diseñar diferentes esquemas de purificación.
• Lograrque la proteína elegida quede tan pura como sea posible.

MÉTODOS DE PURIFICACIÓN REALIZADOS:

Para la PROTEÍNA 18:
(realizado en paralelo con el instructor y los compañeros)

*Fraccionamiento con sulfato de amonio: se saturó con 47% de sal, en el precipitado se perdió 45% de proteína y 0,2% de actividad; se siguió con el sobrenadante.
Enriquecimiento: 1,8
Rendimiento: 99,8%
*Electroforesis unidimensional(e inmunoblot) se vio que la proteína pesa entre 9 y 14 kDa
* Filtración en gel(que diluye la muestra mejor es realizarlo siempre al principio)
Se utilizó una columnaG-50 sephadex
Enriquecimiento: 3,6
Rendimiento: 98,3%
* Cromatografía de intercambio iónico (se vio con una electroforesis que el PI de la proteína es de aproximadamente 6);por ende se uso un flujocon un PH:6,2 con una columna con carga positiva( Q-sepharosa );gradiente de sal de 0 a 0,5 M
Enriquecimiento: 14,2
Rendimiento: 38,1%
Luego en una última electroforesis se observó que había unasola banda que correspondía a la proteína 18.
* Se podía realizar un paso EXTRA: cromatografía de afinidad(aunque tenía el inconveniente de que era muy costoso)

Para la PROTEÍNA 5:

*Fraccionamiento con sulfato de amonio en una concentración de 35: se siguió con el precipitado 28%, con una actividad enzimática de 98%, enriquecimiento de 3,5 y total de proteínas 143,1 ml
*Electroforesis unidimensional y otra bidimensional se vio que la proteína pesa JUSTO 50 kDa , y posee un PI de aproximadamente 7,2.
(en la electroforesis bidimensional se pudo ver que la muestra estaba...
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