Cuantificación de proteínas método de bradford

I. Introducción


Determinar la concentración de proteínas en experimentos biológicos es una técnica necesaria cuándo se quiere descubrir la alta purificación de las proteínas. Se sabe que las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes en todas las células, formadas por largas cadenas de aminoácidos, y que cada aminoácido es conformado por un grupo amino (NH3), carboxilo(COO-), un hidrógeno (H) y un grupo R (Dónde R es diferente para cada aminoácido) [1]. Para saber con exactitud la cantidad de cada proteína, existen diferentes métodos. Los que se utilizan habitualmente son el de Biuret, que se basa en la formación de un complejo de y los grupos NH (Del enlace peptídico), esto nos dice que la intensidad de coloración es proporcional a la cantidad de proteínas. Elotro método es el BCA, en dónde acá actúa el ácido bicinconínico dónde es capaz de formar un complejo purpura con iones de , que nos proporciona un método muy sensible y rápido en dónde algunos compuestos se ven afectados por otros [2]. El método de Bradford en cambio, está basado en la cuantificación del colorante azul brillante de Coomassie G- 250 unido a una proteína cualquiera dependiendo dela muestra. La unión del colorante con la proteína provoca el cambio en absorción desde 465 a 595nm ya que si cambia de color significa que se unió satisfactoriamente a la proteína. Su principal ventaja es que resulta más rápido y barato que otros métodos, pero su desventaja es que en presencia de detergente, cómo el SDS, se genera interferencia [3]. El objetivo de este práctico es usar este mismométodo para conocer la concentración de cada proteína y la cuantificación de estas dentro de una muestra problema.

II. Método de trabajo

El método que se utilizó durante el trabajo práctico de laboratorio, corresponde al Método de Bradford, muy conocido por su alta sensibilidad, bajo costo y rapidez en sus resultados. Su finalidad es la cuantificación de la unión colorante proteína, queen este caso es la proteína Albumina Sérica Bovino y el siempre utilizado en este método colorante Azul Brillante de Coomassie G-250.
El procedimiento comenzó con la preparación de los eppendorf. Se marcó cada tubo en la tapa con números correlativos del uno al cinco, más un blanco (B), cada uno por duplicado. Se ordenaron en la gradilla incluyendo la muestra problema que proporcionó ellaboratorio solo con 50 µl de muestra Standar.

Tabla 1.1 Protocolo tipo para la cuantificación de proteínas.
 
Reactivos
Tubo
Estándar
H2O
Bradford
1
4 µl
46 µl
200 µl
2
12 µl
38 µl
200 µl
3
20 µl
30 µl
200 µl
4
28 µl
22 µl
200 µl
5
36 µl
14 µl
200 µl
B
0
50 µl
200 µl
MP
50 µl
0
200 µl
* Blanco (B)
* Muestra Problema (MP)

Los 200 µl de Bradford fueron puestos alfinal en todos los tubos incluyendo a la muestra problema, pues la reacción del colorante se produce en un tiempo de cinco minutos; y lo ideal es que se produzcan todas a un mismo tiempo. Es ahí donde el Bradford comienzó a tomar su color azul, variando su intensidad según la concentración de proteína en cada muestra.
Posterior a lo realizado se tomaron 250 µl de cada eppendorf y se pusieron enla placa de microtitulación; tomando en cuenta de no pipetear en el centro de los pocillos, pues aumenta la cantidad de errores finales. Es esta placa la que se llevó al Espectofotometro para leer la absorbancia de proteínas a 595 nm frente a la concentración del blanco a una temperatura ambiente en todo momento.
Como precaución al aplicar cada solución diferente, se hizo cambio de los tips, paradisminuir la contaminación entre muestras. Así también se tuvo en cuenta la manipulación de la micropipeta, que esta fuera lo más correcta posible, desde la calibración hasta la manera de tomar la muestra y aplicarla al eppendorf. Pues todo error de manejo de instrumento o del mismo en cuestión, pudo influir en el resultado final de las absorbancias obtenidas.







III. Resultados
A...