Curva estandar

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CURVA ESTANDAR


OBJETIVO:

✓ Analizar el diseño de una curva estándar
✓ Desarrollar una curva estándar
✓ Determinar la concentración de albumina en la clara de huevo

Introduccion:

La albúmina es una sustancia orgánica nitrogenada, viscosa, soluble en agua, coagulable por el calor, contenida en la clara de huevo.

La clara, también conocida como albumen, tiene un 88por ciento de agua y el resto está constituido básicamente por proteínas de la clara, siendo la principal la ovoalbúmina, que representa el 54 por ciento del total proteico.

La curva estándar o patrón es una descripción cuantitativa y resumida que sirve como referencia para determinar la concentración de una sustancia, particularmente proteínas y DNA, en una alícuota. Con el objeto de conocer laconfiabilidad de nuestro trabajo experimental en el laboratorio y el de poner en práctica conocimientos teóricos sobre la determinación de concentraciones.

Para el uso del espectrofotómetro
1. Seleccionar la longitud de onda adecuada y comprobar si la fuente de iluminación y el fototubo corresponden a la misma.
2. Encender el aparato al menos 30 minutos antes de su uso para obtener unaperfecta estabilización de su línea de base.
3. Ajustar el aparato a transmitancia cero: con el receptáculo de muestras vacío y la tapa del mismo cerrada, girar el botón izquierdo del aparato hasta hacer coincidir la aguja con el punto cero de la escala de transmitancia.
4. Ajustar el aparato a transmitancia 100%: Se introduce el blanco (en su tubo adecuado) en el receptáculo de muestras, habiendocuidado de la limpieza y de la transparencia del tubo. Se baja la tapa del receptáculo y mediante el botón derecho se lleva la aguja hasta coincidir con el 100% de transmitancia. A continuación se saca este tubo y se comprueba que la aguja se coloca exactamente frente al cero.
5. Medir cada una de las muestras:
a) medir en la escala de absorbancia, ya que según la ley de Beer-Lambert laconcentración es proporcional a la absorbancia, pero como esta escala es logarítmica, para valores altos de absorbancia, las mediciones se hacen imprecisas
b) o bien medir las transmitancias, cuya escala es lineal, y convertirlas después a absorbancia mediante la relación.
A = log (100/T)
Una vez obtenidas las absorbancias, encontrar la relación entre absorbancia y concentración de proteínas.El método de Lowry.
Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de proteína, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante varía entre las distintas proteínas. Pero cuando tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos perfectamente calibrar el método con algunaproteína comercial, como es la albumina de huevo. El método de Lowry se desarrolla en las siguientes fases:
1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2 en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico.
2.-Reacción con el reactivo deFolin-Ciocalteau para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos máximos de absorción a las longitudes de onda de 640 nm. La selección depende de la concentraciónproteica de la muestra estudiada. Dado que este método da resultados variables se requiere una curva de calibración que se hace a partir de la albúmina de huevo. En la presente práctica haremos esta curva de calibración, practicando la reacción de Lowry y aprendiendo el uso del espectrofotómetro.

Material:

Na2Co3 al 2% en NaOH al 0.1N
CuSO4 5H2O al 0.5% en tartrato de sodio y potasio al 1%...
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