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PREPARACIÓN CEPAS / RESULTADO TRAS UNA INCUBACIÓN

Incubamos cada pastilla 72 horas ± 1 hora en 25 ml de APT a
37 ºC (de viernes a lunes), el lunes inoculamos en PCA haciendo el recuento el miércoles.

Cogemos 1 ml de cada solución madre de cada cepa y se añaden 24 ml de APT manteniendo en refrigeración .

De los recuentos obtenidos el miércoles de cada cepa tenemos que hacerdiluciones para obtener la solución de 1,0 x 107, que será nuestra solución de trabajo (ST), de la vamos a partir para hacer el calibrado y ver la concentración que realmente tienen nuestras cepas en el momento de hacer las muestras.

Cogemos cada ST (1 x 107) y diluimos hasta valores donde podamos contar:

➢ ST (1 x 107) ( ST-1 ( ST-2 ( ST-3 ( ST-4 ( ST-5

Vamos a buscar valores de30, 100 y 300 colonias de cada cepa en PCA tanto para saber la concentración que realmente tiene cada cepa, como para hecer un calibrado en 3 puntos, vamos a hacer las pruebas con 4 placas para cada punto y para cada cepa.

➢ 300 μl de ST-5 ( 30 ufc/placa (será Patrón calibración 1)

➢ 1000 μl de ST-5 ( 100 ufc/placa (será Patrón calibración 2)

➢ 300 μl de ST-4 ( 300ufc/placa (será Patrón calibración 3)

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE CADA CEPA DE CONCENTRACIÓN ELEVADA Y DE LA SOLUCIÓN INICIAL “I” A PARTIR DE CADA CEPA

Cuando conozcamos la concentración de cada una de nuestras cepas, pasaremos a preparar la solución de partida o inicial “I” que tendrá que ser de 1 x 107, en cada cepa para que luego desde esta solución (I), preparar la muestras(MATERIALES DE REFERENCIA) que serán las muestras con una concentración conocida de bacterias.

Cuando la concentración de cada cepa es superior a 1 x 108, no tendremos problemas, puesto que son 10 tipos diferentes de cepas, en un volumen final de 10 ml, luego una concentración de 1 x 107 cogiendo 1 ml de cada cepa de 1 x 108 , para lo que previamente habremos llevado cada cepa a un concentración de1 x 108por dilución.

En el caso de cepas de concentración de 1 x 107 hasta 1 x 108 , tendríamos que diluir hasta 1 x 107, y luego añadir esa cepa concretamente en concentración 1 : 9 (cepa:leche) para tener esa cepa en concentración 1 x 106 , en la solución A que es de 1 x 106 en cada cepa. En estos casos la solución I la complementaríamos con los ml de APT necesarios para compesarlas cepas no añadidas.

Si la concentración de las cepas es inferior a 5 x 106 ya no podríamos utilizar esa cepa para el recuento de Aerobios de MR1 (1 x 107), pero se podría introducir más tarde. Si es de 5 x 106 añadimos en concentración 2:8 (2cepa 5 x 106:8 leche) y tendríamos 1 x 106 de esa cepa en la solución A quitando ese 20 % y añadiendo la cepa en APT.

PREPARACIÓN DE LASSOLUCIONES DE PARTIDA Y DE LOS MATERIALES DE REFERENCIA

|A-1 |A-2 |A-3 |A-4 |A-5 |
|2 g. Muestra | | | | 2 ml A-4 |
|+ 16 ml APT | | ||+ 18 ml APT |
|+ 2 ml I (mezcla cepas, 1| | | | |
|x 106 | | | | |

|B-1 |B-2 |B-3|B-4 | |
|2 g. Muestra | | | 3 ml B-3 | |
|+ 16 ml APT | | |+ 27 ml APT | |
|+ 2 ml A-1 | | |...
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