Determinacion de concentraciones proteicas

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LABORATORIO Nº 4

DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS

-2010-

INTRODUCCION

Para la determinación de concentraciones proteicas utilizaremos la colorimetría, el fundamento de esta técnica consiste en que si se pasa la luz blanca a través de una solución coloreada, algunas longitudes de onda se absorben con preferencia sobre las otras. Muchos compuestos no son coloreados, peropueden absorber luz en la región visible si se someten a la acción de un reactivo apropiado. Estas reacciones son específicas y muy sensibles, hasta el punto de poder medir cantidades de material en concentraciones de milimol por litro. La intensidad del color es proporcional a la concentración del compuesto que se mide, mientras que la cantidad de luz absorbida es proporcional a la intensidaddel color y por lo tanto a la concentración (1).

La absorbancia se puede determinar por la ley de Beer-Lambert, de acuerdo a los cálculos realizados en el práctico. La ley dice que cuando se pasa un rayo de luz monocromático de intensidad inicial I0 a través de una solución en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de manera que la intensidad de la luz transmitida I es menorque I0. Ocurre alguna disminución en la intensidad de la luz por dispersión de las partículas o reflexión en las interfases, pero principalmente por absorción de la solución. La relación entre I e I0 depende de la longitud del medio absorbente, l, y de la concentración de la solución absorbente, c (2).

Log ( Io/I )= εcl

En nuestro práctico de laboratorio realizaremos la cuantificación deproteínas por medio de métodos colorimétricos, de los cuales los más conocidos y utilizados son:

Método de Biuret: Se basa en la reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino. El cobre es reducido a Cu+ formando complejos de color púrpura. Éste método se usa para soluciones que tienen un rango de 0,5 a 10 [mg proteína/mL].

Métodode Bradford: Se basa en la propiedad del colorante Azul de Coomassie G-250 de unirse a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra café. Este método es sensible, trabaja en un rango de 0 a 30 [μg] de proteínas, es simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y lassoluciones básicas.

Método de Lowry: Resulta de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos, además de la reducción del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteau) por las proteínas pre-tratadas con cobre en medio alcalino. El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptófano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin produciendo un producto inestable que es reducido aazul de molibdeno/tungsteno. Este es un método muy sensible, por lo que permite trabajar con soluciones muy diluidas de proteínas (0.02 – 0,5 [μg proteína/mL]).

Objetivo: El objetivo del laboratorio es utilizar el método colorimétrico de Biuret para realizar la cuantificación de proteína en una muestra problema asignada.

MATERIALES Y METODOS

Materiales:

20 tubos de ensayo.

3 micropipetas: P 1000- P200- P20.

1 Vaso precipitado.

2 Pipetas de 10 mL.

Matraz 50 mL.

1 Propipeta.

Puntas para micropipetas.

Espectrofotómetro.

7 celdas para medir absorvancia.

Reactivos:

Reactivo de Biuret

Agua destilada

Metodología:

Al comenzar el laboratorio, el profesor nos asignó a cada grupo de trabajo un tubo específico. A nuestro grupo le tocó el tubonumero 4 ([P]= 8mg; Biuret= 4mL; H2O= 920 µL; Cantidad de Proteína= 80 µL). Correspondiente al método de Biuret.

Primero que todo, se dispuso de 6 tubos de ensayo, marcados desde el numero 1 al 6. En cada uno de los tubos partiendo desde el 1 hasta el 5, procedimos a pipetear 4 mL del reactivo de Biuret y luego se procedió a agregar a cada tubo 980, 960, 940, 920 y 900 µL de agua destilada...
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