Determinacion de la cinetica enzimatica d ela fosfatasa acida

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  • Publicado : 5 de diciembre de 2011
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Determinación de la cinética enzimática de la fosfatasa acida

Introducción

La proteínas son parte fundamental dentro de nuestro organismo, ya que estas realizan variadas funciones, la que nos interesa en este practico es la función enzimática. Las enzimas catalizan reacciones biológicas, haciéndolas cinéticamente favorables; es decir que las reacciones sean más rápidas al actuarcon una enzima que al estar sin ella. Además estas disminuyen la energía de activación, lo cual permite la aceleración de la reacción sin afectar el equilibrio de la reacción. Es así como las enzimas actúan en diversas reacciones bioquímicas, como por ejemplo en el metabolismo de nutrientes o transformaciones de macromoléculas, entre otras. (1)

La enzimas actúan con una alta especificidad sobreunas moléculas llamadas sustratos, las cuales se convierten en otras moléculas llamadas productos. La forma de actuar se define de la siguiente manera:

E + S (( ES (( EP (( E + P

Aquí la E, S y P representan Enzima, Sustrato y Producto respectivamente. También encontramos ES y EP estos son complejos transitorios de enzima sustrato y enzima producto. La ecuación anterior es la forma mássencilla de representar como actúa una enzima. (1)

La enzimas pueden ser clasificadas según su función específica, como por ejemplo Transferasas, Oxidorreductasas, Ligasas, Liasas, Hidrolasas entre otras (2). La enzima a estudiar en este práctico es la Fosfatasa Acida de germen de trigo, la cual cataliza reacciones de hidrólisis de fosfatos monoésteres con la liberación de un FosfatoInorgánico (Pi) de acuerdo a la siguiente reacción (3):

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Al momento de hablar del funcionamiento de las enzimas debemos tener en cuenta diferentes factores los cuales afectan al óptimo funcionamiento de estas en una reacción. Como por ejemplo el pH, la temperatura, cantidad de sustrato y la concentración de la propia enzima. Otros factores que pueden modificar la actividad enzimática son losinhibidores enzimáticos los cuales impiden o inhiben completamente en funcionamiento de las enzimas. (4)

A través de la cinética enzimática podemos entender el mecanismo de reacción de las enzimas, es así como la mayoría de estas actúan según el modelo de cinética de Michaelis-Menten, seguida por la siguiente ecuación (5):

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Es por intermedio de la ecuación anterior, que encontramos losparámetros cinéticos como Km (representa la cantidad de sustrato cuando se encuentras a la mitad de la velocidad máxima) y Vmáx (velocidad máxima a la cual puede trabajar la enzima), los cuales son importantes para entender el mecanismo de la enzima. (5)

Objetivos

En este práctico tenemos como objetivo determinar las condiciones óptimas de trabajo de la Fosfatasa ácida de germen detrigo como la temperatura y pH.

Determinar los parámetros cinéticos de la Fosfatasa ácida de germen de trigo, es decir Km y Vmáx en ausencia y presencia de un inhibidor.

Procedimiento experimental

1.1 Elaboración de una curva de calibración de p-nitrofenol.

Se preparan 6 tubos eppendorf en los cuales a cada uno se le añade 0, 125, 250, 500, 750, 1000 (L de p-nitrofenol 60 (M yposteriormente se enrasan a 1 mL con NaOH 0,05 M. A cada tubo se le extrajo 200(L de muestra y se les midió la absorbancia a 405 nm en el detector de Elisa, para la posterior confección del gráfico concentración v/s absorbancia que nos permitirá obtener la curva de calibración de p-nitrofenol, la que será utilizada como patrón.

1.2 Determinación de la temperatura óptima para la actividad de la fosfatasaacida de germen de trigo a pH 5.

Se preparan 3 tubos eppendorf (A, B, C) en los que se le colocó a cada uno 200 (L de amortiguador (citrato) y 200 (L de sustrato p-nitrofenil fosfato (p-NPP 2,5 mM diluido en buffer citrato), los cuales fueron preincubados a 4 °C, 37°C y 60°C por 3 minutos. Luego de los 3 minutos se les agrega a cada tubo eppendorf 100 (L de una dilución de enzima...
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