Determinacion de proteinas por el metodo de lowry y bradford

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DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BRADFORD Y LOWRY.

INTRODUCCION.
Método de Lowry:
Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer

Este método consta de dos etapas:1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ semantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, queal ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Método de Bradford:
Está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio enel máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).

OBJETIVOS
*Elaborara una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
* Determinara si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.
* Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color.
* Analizara las ventajas y desventajas del método Lowry, con respecto a otrosmétodos para la cuantificación de proteínas.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME.
Tabla 3. Curva de calibración de albumina. Método de Lowry
Tubo Nº | Cantidad de proteína (μg) | A 590 | Serie ajustada por regresión lineal. |
| | Serie a | Serie b | |
1 | 25 | 0.066* | 0.062* | 0.066 |
2 | 50 | 0.126* | 0.161 | 0.120 |
3 | 75 | 0.178 | 0.208 | 0.174 |
4 | 100 | 0.231* | 0.244 | 0.229|
5 | 125 | 0.281* | 0.291 | 0.283 |
*Datos tomados para la realización de la curva tipo.
Grafica 3. Curva de calibración de albumina. Método de Lowry

Grafica 3. Curva de calibración de albumina. Método de Lowry (serie ajustada)
Abs

Método de Lowry: Ecuación de la recta.
y = bx + a a= 0.012 b= 0.00217 r= 0.99926
a) Calcule y escriba los valores de la pendiente, laordenada al origen, y el coeficiente de correlacion; diga como se interpretan para la curva de calibración.
b = 0.00217 y refiere a la sensibilidad del método, a= 0.012 es una constante lo cual quiere decir que este valor no depende del cambio en la concentración de proteína, siendo un valor de referencia de la curva (blanco), el valor del coeficiente de correlación r= 0.99926 refiere a lareproducibilidad de los datos lo que acredita al analista.
b) ¿Cumple su curva la ley de Bouger y Beer? ¿Entre que limites de cantidad de proteína?

El método de Lowry si obedece la ley, Los limites se encuentran entre 25 – 125 microgramos; por tanto, esos limites nos indican que la proporcionalidad en la cantidad de proteína aumenta con respecto a la absorbancia de la muestra....
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