Determinacion de proteínas por el método de lowry y bradford

INTRODUCCIÓN

El método de Lowry utiliza el reactivo de fenol-Folin-Ciocalteu. En este método se desarrollan dos reacciones coloridas: primero se desarrolla un color de poca intensidad con el cobre en medio alcalino; después se forma un color azul-verde con el reactivo mencionado, que contiene molibdato de sodio y tungstato de sodio en presencia de ácido fosfórico y clorhídrico, que reaccionacon los aminoácidos aromáticos, fenilalanina y triptófano de la proteína. Este método permite determinar la concentración de proteína en rangos de 0.01-1 mg/mL.

En este experimento se preparará una curva de calibración utilizando hemoglobina. La curva de calibración se construye llevando a cabo la reacción de Biuret y/o Lowry con concentraciones crecientes de hemoglobina, lo que genera tubos conintensidad creciente de color. La intensidad del color formado se puede interpolar en la curva de calibración de la hemoglobina, y así determinar un valor aproximado de su concentración.

Un método rápido y acertado para la estimación de concentración de proteína es esencial en varios campos del estudio de proteínas. Un ensayo original descrito por Bradford se ha vuelto el preferido para lacuantificación de proteínas en muchos laboratorios. Esta técnica es más simple, rápida y sensitiva que el método de Lowry, está sujeto a menos interferencia por reactivos comunes y compuestos no proteínicos de muestras biológicas.

El método Bradford se basa en la unión del azul de Coomassie G250 con la proteína. La forma aniónica del colorante, la cual predomina en solución ácida, tiene unalongitud de onda máxima de 470 nm. En contraste, la forma catiónica del colorante que se une a la proteína, tiene una longitud de onda máxima de 595 nm. De esta manera, la cantidad de azul de Coomassie unido a la proteína puede ser cuantificado midiendo la absorbancia de la solución a 595 nm.


OBJETIVOS

a) Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas mediante un métodofotométrico.
b) Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.
c) Conocer el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color.
d) Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry y Bradford, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas.

RESULTADOS Y CÁLCULOS

Métodode Lowry.
Curva de calibración de hemoglobina.

Tubo no. | Cantidad de proteína (µg) | A590 |
| | Serie a | Serie b |
1 | 25 | 0.029 | 0.061 |
2 | 50 | 0.128 | 0.124 |
3 | 75 | 0.149 | 0.160 |
4 | 100 | 0.190 | 0.209 |
5 | 125 | 0.252 | 0.295 |

Réplicas para el análisis estadístico.

Tubo no. | A595 | Cantidad de proteína (µg) |
1 | 0.166 | 78.81 |
2 | 0.192 | 91.19 |3 | 0.201 | 95.48 |
4 | 0.151 | 71.67 |
5 | 0.174 | 82.62 |
6 | 0.199 | 94.52 |
7 | 0.144 | 68.33 |
8 | 0.195 | 92.62 |
9 | 0.196 | 93.10 |
10 | 0.203 | 96.43 |
|
| X | 86.48 |
| S | 10.39 |
| S2 | 107.95 |
| CV | 12.01 % |

Una vez que se realizó la curva tipo y se tienen los valores de absorbancia (nm) de los 10 tubos preparados para el análisis estadístico seprocede a calcular la cantidad de proteína (µg) hemoglobina mediante el uso de la ecuación de la recta de la curva de calibración y = 0.0021x + 0.0005, de aquí se despeja a la variable “x” la cual representa la cantidad de proteína y se sustituye “y”, valor de absorbancia. Así se obtiene para el tubo 1, por ejemplo:

x=0.166-0.00050.0021=78.81

El coeficiente de variación se calcula mediante:x=SX×100 %= 10.3986.48×100 %=12.01 %

Método de Bradford.
Curva de calibración de hemoglobina.

Tubo no. | Cantidad de proteína (µg) | A595 |
| | Serie a | Serie b |
1 | 25 | 0.172 | 0.250 |
2 | 50 | 0.300 | 0.377 |
3 | 75 | 0.408 | 0.405 |
4 | 100 | 0.420 | 0.500 |
5 | 125 | 0.502 | 0.564 |
| | | |

Réplicas para el análisis estadístico.

Tubo no. | A595 | Cantidad...