Determinacion Polisacarido B Por Hplc

ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOQUÍMICA Y FARMACIA
TRABAJO DE EXPOSICIÓN DE ANÁLISIS QUÍMICO INSTRUMENTAL II
TEMA: VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE DETERMINACIÓN DEL POLISACÁRIDO B RESIDUAL EN VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA DE NEISSERIA MENINGITIDIS.

INTEGRANTES: Estefanía López
Nathaly Chafla
Poleth Ortiz
Sandra Cortés
NIVEL: QUINTOPARALELO: “A”
FECHA DE ENTREGA: 05 DE NOVIEMBRE DE 2012
Validación de un método de determinación del polisacárido B residual en vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis.

Jannete Rico, Yaima Merchán, Matilde Cuevas, Jenny Márquez.
Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología (INOR). Calle 29 y E. Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. Instituto Finlay. Centro deInvestigación - Producción de Vacunas. Ave. 27 No. 19805. AP. 16017, CP11600. La Lisa, Ciudad de la Habana, Cuba. email: ymerchan@finlay.edu.cu

La Cromatografía Líquida de Alta Resolución-Fluorescencia ha resultado ser una herramienta sensible para la detección de trazas en productos farmacéuticos y es utilizada frecuentemente para la cuantificación de algunos polisacáridos de origen bacteriano que poseenácido siálico como unidad repetitiva. En este trabajo nos planteamos como objetivo establecer y validar el método de HPLC–Fluorescencia, para determinar el contenido de polisacárido B residual en vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis. Para ello se realizó el montaje del método HPLC-FL, utilizando una columna de fase reversa C18 (Ultrasphere ODS, Beckman, USA) y se evaluaron seislotes de vesículas de membrana externa de diferentes cepas Cu 385/83 y NZ 228. Se demostró que este método permitió la cuantificación de polisacárido B de una forma específica y exacta, y que cumplía con todos los parámetros de validación establecidos para un método de determinación de trazas mediante HPLC.

INTRODUCCIÓN

Las vesículas de membrana externa (VME), Ingrediente Farmacéutico Activo(IFA) de las vacunas antimeningocócicas cubanas VA-MENGOC-BC® y Men B, poseen un contenido residual de polisacárido B que queda como remanente del proceso de purificación a partir de Neisseria meningitidis, serogrupo B. Para la cuantificación de la concentración de polisacárido B contaminante se utiliza el método colorimétrico, descrito por Svernnerholm, mediante el cual se cuantifican lasconcentraciones de polisacáridos polisialilados en muestras de proteínas semipurificadas en diferentes etapas del proceso y muestras de alto contenido polisacarídico en general (1). Sin embargo, este método no puede ser utilizado para evaluar las muestras en estudio (2) por la posible interferencia de la sacarosa, excipiente en que se encuentran conservadas.
La Cromatografía Líquida de Alta Resolución,acoplada a un detector de Fluorescencia (HPLC-Fluorescencia), ha resultado ser en nuestros días una herramienta más sensible para la detección de trazas, mediante la cual pueden ser detectados fácilmente alrededor de 0,1 pmol de polisacárido y menos de 0,2 pmoles de ácido siálico. La determinación cuantitativa del ácido N-acetilneuramínico (NANA), mediante HPLC-Fluorescencia, es utilizadafrecuentemente para la
cuantificación de algunos polisacáridos de origen bacteriano que poseen ácido siálico como unidad repetitiva, donde el NANA es derivatizado con O-fenilendiamina para formar un derivado de quinoxalina fluorescente estable, que es separado del exceso de reactivo mediante una columna de fase reversa C18 (3).
En la actualidad las exigencias de las empresas comercializadoras del primermundo son mayores y requieren de un producto altamente caracterizado y controlado sobre la base de las más avanzadas técnicas de evaluación (4).
Los resultados de los procedimientos analíticos deben ser fiables, precisos y reproducibles. Los parámetros fundamentales que deben ser considerados durante la validación de los métodos de análisis para su aprobación incluyen: la exactitud, la...