Dilucion de primers y pcr

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  • Publicado : 14 de mayo de 2011
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Dilucion de Primers y PCR
Como se sabe los primers son pequeños fragmentos de ácidos nucleicos que sirven como punto de inicio para la síntesis de ADN. Estos pequeños fragmentos son muy usados en el campo investigativo ya que son esenciales para la replicación de material genético; ayudando de esta manera a encontrar por ejemplo la supresión o segregación de polimorfismos en cuanto a herencia.Por lo tanto para el estudio del material genético son necesarias varias copias de una segmento de ADN lo cual es posible mediante la cadena de reacción polimerasa o PCR técnica mediada por un termociclador.

Los primers son pequeñas secuencias de ácidos nucleicos usadas como punto de inicio para la replicación de ADN, que contienen un grupo hidroxilo 3’ libre que forma pares de bases con unahebra molde complementario por lo que actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos.
Los primers también denominados oligonucleótidos, cebadores, o iniciadores estos se usan en prácticas en una concentración de 1uM.
Además cabe recalcar que los primers son universales, es decir que anillan el gen del ARN ribosómico 16S  de cualquier bacteria. Esto es porque las secuencias a loscuales se "pega" el primer son extremadamente similares entre las especies bacterianas.
La especie bacteriana más estudiada es la e. coli no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole.
La E. coli es de una estructura simple, integrada por bacilos Gram negativos no esporulados; estasbacterias son capaces de crecer en agar Mac Conkey y en medios simples. Este tipo de bacterias son conocidas como los ratones de laboratorio de la microbiología ya que son bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales. Son pertenecientes a las enterobacterias que habitualmente forman parte de la flora normal del colon humano, enescaso porcentaje (más del 98 % de la flora intestinal son anaerobios de los géneros Bacteroides y Prevotella). Pueden encontrarse transitoriamente en la piel (especialmente perianal), el tracto genital femenino y, muy ocasionalmente, el tracto respiratorio superior de los individuos sanos.
ANALISIS DE SECUENCIAS DE UN PRIMER: Cuando se diseñan primers para PCR, secuenciación de ADN, o muta génesises necesario saber ciertas condiciones del mismo para comenzar dichos procesos es decir es muy importante tomar en cuenta ciertas condiciones químicas y físicas para lograr un resultado óptimo.
La longitud de cada primer debe ser entre 18 y 24 bases. Primers de mayor longitud pueden causar multiplegamientos y primers demasiado cortos no serán de mucha ayuda. La temperatura de derretimientopuede no ser igual en cada primer pero este no es un factor que altere mucho la practica sin embargo debe ser entre 5°C mas o menos. El contenido de purinas y pirimidinas debe estar en equivalencia de 1:1.
PCR cadena de reacción polimerasa es la amplificación por medio de la polimerización en cadena de ADN utilizando u termociclador. El propósito de la PCR es hacer varias copias de un fragmento deADN. Se realiza la amplificación de un segmento específico de ADN teniendo poco material disponible. Esta técnica fue diseñada por Dr. Kary Mullis en 1987 quien ganó el premio Nobel de Química en 1993 por su invento.
Utilizo el PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme. La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” Termociclado; es unamáquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo. La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.

Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones

Objetivos.
1. Obtener alícuotas mediante primers liofilizados diluidos,...
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