Electroforesis En Gel De Agarosa De Adn Plasmídico

INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR


Trabajo Práctico Nº 2
“Electroforesis en gel de agarosa”





Introducción
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico y de forma circular, que se encuentran en muchas especies bacterianas (y en algunas eucariotas, por ejemplo plantas y levaduras). No son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero puedencontener genes que contribuyan a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos.
Para el desarrollo del TP es importante destacar las diferencias existentes entre el ADN plasmídico y el cromosómico, ya que a partir de estas, se puede extraer el plásmido con mayor rendimiento. Por ejemplo, la diferencia entre el tamaño, siendo el cromosómiconotablemente más grande (4000 kPb), mientras que el plasmídico tiene apenas aprox 3 kPb. Por otro lado, como ya se mencionó, este último no es vital para la existencia de la célula, se caracterizan porque se replican de manera independiente del DNA cromosómico, teniendo su propio origen de replicación.
El número de copias plasmídicas por célula está regulada por el “represor”, elemento que controlala tasa de replicación. De esta manera, se dividen en tres grupos: plásmidos con bajo (1 a 5), medio (5 a 20) o alto (20 a 200) número de copias. En este caso, se trabajará con una batería con alto número de copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación, a pesar de poseer poca cantidad de bacterias.
Para poder trabajar correctamente con plásmidos puros, esnecesario someterlos a una purificación previa, lo cual consiste en un total aislamiento de los componentes del resto de la bacteria. In vivo los plásmidos se encuentran superenrrollados, covalentemente cerrados (CCC), sin embargo al ser purificados pueden conservar su forma y /o adquirir otras dos: Círculo abierto (CA), donde una de las hebras fue cortada, aliviando la tensión delsuperenrrollamiento, y dando lugar a moléculas circulares por algún error o daño durante la manipulación y por último, Lineal (OC), en la cual las dos hebras son cortadas originando una molécula de forma lineal por el agregado de enzimas de restricción.
Uno de los métodos para identificar las formas que adquiere el ADN luego de ser manipulado, es la electroforesis en gel, una técnica de separación demacromoléculas orgánicas de acuerdo a su peso molecular, que consiste en la migración de partículas cargadas de un polo a otro al ser sometidas a un campo eléctrico. En este caso las partículas en cuestión son las moléculas de ADN plasmídico (pBluescript II) de la Bacteria E. Coli (Bacteria Gram -); al estar cargadas negativamente, por los grupos fosfato que contienen, migrarán hacía el ánodo.Las fuerzas que determinan la migración de las moléculas son dos:
Fuerza eléctrica: proporcional a la carga, esta se da en el mismo sentido que la corrida.

Fuerza de rozamiento: va en contra de la corrida. Depende de los siguientes factores: las características del medio, como por ejemplo el % m/v del material que constituye el gel, lo que determinará el tamaño del poro. Y por otrolado la forma y el tamaño de las moléculas. En casos donde se trabaja con ADN es necesaria un matriz de gel ya que si fuera acuosa, esta fuerza no existiría y todas las moléculas migrarían juntas, sin poder separarlas.

Objetivos
Teniendo en cuenta los conocimientos planteados en la introducción, se plantean los siguientes objetivos:
• Estimar el tamaño del fragmento incógnita de mayormovilidad de la calle “P”.
• Inferir en la foto del experimento (ver imagen 1) las isoformas del plásmido preparado.

Desarrollo experimental
El método utilizado para la obtención de plásmido purificado, en esta práctica se denomina “lisis alcalina” y se basa en la desnaturalización selectiva del DNA cromosómico mediante alcalinización con NaOH y adición de SDS (detergente), en...