Electroforesis en geles de agarosa

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 2
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

Objetivos:

Utilización del método electroforesis para analizar el peso molecular (PM) de moléculas de ADN plasmídico previamente purificado y re-suspendido en 20µl de agua MilliQ.

Introducción:

La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas al ser sometidas a un campo eléctrico.
Los ácidos nucleicos están cargadosde forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato; por lo tanto, en el caso de nuestra muestra, al contener ADN plasmídico, la misma migrará hacia el polo positivo. Al desplazarse a través de una matriz porosa, gel de agarosa en nuestro caso, las moléculas de ADN son sometidas a dos fuerzas de acción opuestas que determinan la velocidad de las partículas en cuestión: la fuerza eléctrica quelas atrae al electrodo (su intensidad es directamente proporcional a la carga y les impone una aceleración directamente proporcional al cociente entre la carga y la masa.) y el rozamiento viscoso que se opone a su migración (la intensidad de dicha fuerza depende de la forma y el tamaño de las partículas y de las características del medio.).

Metodología:

La metodología aplicada para larealización del experimento es la descripta en la guía de trabajos prácticos de IBMC 2011.

Gel TP 8 poco expuesto

En la primera calle se observa el DNA superenrollado. Tal como se encuentra en la bacteria.
En la segunda calle se ve la banda lineal o sea el largo del plásmido, a este DNA se lo trato con la enzima de restricción Eco RI, que es una enzima que corta el DNA plasmídico en un únicolugar.
En la tercera calle se trato con enzimas PVU II que corta en dos lugares al plásmido, y por lo tanto se ven las dos líneas que corresponden a dos tamaños distintos del plásmido.
La cuarta calle es el marker, el marcador de peso molecular de ácidos nucleicos.
El bromuro de etidio migra del polo positivo al negativo (es decir: de abajo hacia arriba en el gel de agarosa – en direccióncontraria al ADN plasmídico).
De la calle 5 a la 11, no se trato el DNA plasmídico con enzimas RNasa. Debido a la presencia de ARN, el bromuro de etidio no llega a migrar lo suficiente como para “marcar” al DNA plasmídico, por lo tanto no llega a distinguirse demasiado y se ve como una gran columna.
De la calle 11 a la 18, la muestra sí fue tratada con enzimas RNasa. Se ve como consecuencia ladistinción más clara del plásmido, debido a la previa desnaturalización del RNA.

Marcador de PM Gel TP 8 Gel TP 8
para ácidos nucleicos muy expuesto poco expuesto
(“DNA ladders”)

En la fotografía del gel poco expuesta, apenas puede notarse lapresencia de moléculas de ADN plasmídico la columna de la muestra analizada (Grupo 1, la primer columna a la derecha del marcador de PM). Sin embargo, en la fotografía del gel muy expuesta, puede verse ligeramente, y es muy parecida a las columnas siguientes, ya que todas fueron re-suspendidas en la misma solución (20µl de agua MilliQ).

Conclusiones/discusiones:

Se cree que la falta devisibilidad de las moléculas de ADN plasmídico en la fotografía del gel de agarosa obtenida mediante la electroforesis, fue a causa de la poca cantidad de pellet obtenida en el TP 1. Luego de la segunda centrifugación, no se pudo divisar el pellet (conteniendo la muestra de ADN plasmídico) y al pipetear el sobrenadante, tal vez, se fue a la pipeta algo del mismo. Dando como resultado, poca cantidad demoléculas de ADN plasmídico en la re-suspensión en 20µl de agua MilliQ, la cual fue utilizada para la realización de la electroforesis en gel de agarosa.

CUESTIONARIO

Cuestionario

1. ¿Por qué se utiliza una solución con buffer en la electroforesis y no agua sola?
Se utiliza una solución con buffer porque así se facilita la siembra de la muestra. Dándole color y densidad a la misma....
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