Electroforesis

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEÓN
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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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Reporte de investigación de electroforesis bidimensional (2DGE).

Introducción
La electroforesis bidimensional 2D-PAGE permite separar hasta miles de proteínas en un solo experimento, y constituye actualmente el método máseficiente para la separación de mezclas muy complejas de proteínas. Está basada en una separación de proteínas de dos dimensiones; en función de la carga, seguida de una separación de las proteínas en función de su masa molecular.
La alta resolución de la técnica se basa en que las dos separaciones se basan en parámetros independientes. La innovación clave para la 2D-PAGE fue el desarrollo degeles con un gradiente de pH inmovilizado (IPG).

La separación de la primera dimensión se realiza mediante isoelectroenfoque, durante el cual las proteínas son separadas en un gradiente de pH hasta alcanzar una posición en la que su carga neta es cero, es decir, su punto isoeléctrico. En una segunda dimensión, las proteínas son separadas mediante electroforesis en presencia de SDS.
El gradientede pH inmovilizado elimina los problemas de inestabilidad del gradiente y baja capacidad de carga que iban asociados a los gradientes de pH preparados con anfolitos acarreadores. En los geles IPG, el gradiente es generado por las llamadas “inmobilinas” y está copolimerizado con la matriz de acrilamida del gel. Este sistema ha permitido mejorar la resolución y reproducibilidad de los geles asícomo aumentar la cantidad de proteína que puede ser cargada. La reproducibilidad conseguida con los IPGs ha hecho posible la comparación de mapas entre distintos laboratorios, facilitando así el intercambio de información.

La preparación de la muestra es el paso más crítico y clave en el éxito del experimento. En él se emplean agentes caotrópicos, surfactantes y agentes reductores. Los agentescaotrópicos como la urea y tiourea, provocan la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno, dejando expuestos los residuos hidrofóbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores como el DTT (aunque también se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalización proteica por ruptura de puentes disulfuro. Enprimer lugar las proteínas se separan en base a su punto isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados (IPGs).
Una vez que las proteínas han sido separadas en función de sus propiedades eléctricas, pasamos a separarlas en función de su tamaño o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS).
Estas dos separaciones sucesivas permitenaislar prácticamente todas las proteínas de un proteoma en una matriz bidimensional (“electroforesis bidimensional”).

La habilidad para adquirir datos en formato digital es uno de los principales factores que hace a los geles bidimensionales ser un práctico medio para recoger información sobre un proteoma. Antes de que los geles donde hemos separado las proteínas puedan ser analizados con unsistema de evaluación de imágenes, éstos deben ser digitalizados. Los instrumentos de adquisición de imágenes más comúnmente usados son los densitómetros (GS800) y los escáneres de fluorescencia (FX ProPlus). Todos ellos funcionan con softwares de análisis diseñados para detectar y cuantificar “spots” en las imágenes digitales así como para comparar y analizar estadísticamente los geles de interés.La aplicación principal de la 2D-PAGE es la proteómica de expresión. En esta aproximación, la expresión de proteínas de dos muestras se puede comparar de forma cuantitativa. La aparición o desaparición de manchas proporciona información sobre la expresión diferencial de proteínas y la intensidad de las manchas permite conocer los niveles de expresión. Para realizar estos estudios se pueden...
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