ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
En este trabajo práctico se utilizó la técnica de electroforesis. Este proceso se basa en la migraciónde las moléculas con carga neta de una muestra, cuando es sometida a un campo eléctrico, hacia el polo opuesto de su carga. Hay dos fuerzas que determinan la velocidad con que una molécula migrará: la fuerza eléctrica y la de rozamiento. La primera es laresponsable de que la molécula en cuestión sea atraída hacia uno de los electrodos. Por esto es que cuanto mayor sea el cociente carga/masa de la molécula mayor será la aceleración con que se mueva. La fuerza de rozamiento tiene una acción opuesta: a mayor rozamientomenor velocidad de migración. Esta fuerza tiene que ver con el tamaño y forma de la molécula que migra, y con las características del medioen que se mueve.En este trabajo práctico realizaremos electroforesis para separar moléculas de DNA doble cadena. La carga neta de estas moléculas está dada por los grupos fosfatos: como hay un fosfato cargado negativamente por cada nucleótido y la masa de los cuatro desoxirribonucléotidos es similar, el cociente carga/masa será independiente de la secuencia y la longitud de la doble cadena de DNA(todas las moléculas de DNA migrarán entonces hacia el ánodo). Esto quiere decir que no nos tendremos que preocupar por la fuerza eléctrica, ya que las diferencias en la migración estarán dadas exclusivamente por la fuerza de rozamiento. Como las moléculas migran en el mismo medio y todas tienen la misma forma, la velocidad de migración tendrá que ver únicamente con el tamaño de las moléculas (lalongitud de la doble cadena, medida en pares de bases). Cuando se corren plásmidos, por ejemplo, no podemos afirmar lo mismo: al tener distintas formas no ocurrirá lo explicado anteriormente. Lo mismo pasaría con RNA o DNA simple cadena que formen apareamientos internos: en esos casos hay que desnaturalizar antes de correr, de modo que resulten cadenaslineales.Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migración adecuado, de modo que laseparación sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las moléculas de distinto tamaño se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste en una red compuesta por un polímero orgánico (en este caso usamos agarosa, derivado de un polisacárido de un alga) y que aumenta considerablemente la fricción,impidiendo a la vez la difusión de las moléculas a través del medio acuoso en todas las direcciones. Al colocar las muestras de DNA a través de este gel y someterlo a un campo eléctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas según su tamaño. La rapidez con que migren las moléculas puede ser regulada por la concentración de agarosa disuelta en buffer que usemos:Mayor concentración, mayor compactación de la red y por tanto menor velocidad de migración. Laconcentración que elijamos dependerá de lo que se quiera separar en cada corrida. Para la corrida de proteínas, el proceso es diferente. Se suele utilizar una solución de poliacrilamida como gel y además las proteínas deben ser tratadas con SDS (detergente), que permite mantener constante el cociente carga/masa ya que las cargas netasde las proteínas nativas sí dependen de su secuencia. El SDS desnaturaliza y recubre los polipéptidos, aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de éstos. De esta manera, las proteínas tratadas con SDS migran hacia el ánodo, al igual que los ácidos nucleicos. Una vez separados los DNA de distintos tamaños, es posible conocer el peso de cada uno ya que el logaritmo del peso moleculares inversamente proporcional a la distancia recorrida.
OBJETIVOS
Estimar tamaño de DNA mediante un gráfico y visualizar topoisómeros.
Desarrollo de electroforesis:
Preparación del gel de agarosa:
Se necesita preparar 120 ml de gel de agarosa 0,8 %:
100 ml de sc --------------0,8 g de agarosa
120 ml de sc--------------0,96 g de agarosa
Llevar a 120 ml de TAE 1X; sc madre TAE 50X:...