Ensayo ologonucleotidos quimica

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Ensayo
Oligonucleotidos

Una de las estrategias más recientemente empleadas es la transferencia de
inductores de formación de triple hélice en el ADN (TFOs), Aunque la formación
de hélice triple con oligonucleótidos fuera descrita desde 1957 solamente se
demostró su factibilidad treinta años después (Helene C. 1994).

Los TFO son:
oligonucleótidos de hebra simple que se acoplan al ADN.Estos oligómeros, o
las secuencias de ADN que los codifican se transfieren clonados en vectores
plasmídicos generalmente.

Los TFOs de ADN o de ARN se aparean con porciones complementarias del
ADN dúplex formadas por homopurinas. Diversas secuencias pueden intervenir
en la tercera hebra (TFO). La cadena de polipirimidinas del TFO reconoce su
secuencia blanco en el ADN y se acopla a ella pormedio de enlaces tipo
Hoogsteen intercalándose en el surco mayor de la espiral (Francois J.C. 1988).

El acoplamiento de la tercera cadena no desestabiliza la doble hélice. Por
medio de enlaces de tipo Hoogsteen la timina reconoce las parejas AT y CG,
la citosina se liga al par GC, la guanina se une al par AT (Minton K.W. 1985).

Debido a la necesidad de protonación de la citosina paraestablecer uniones
tipo Hoogsteen, la triada C*GC es inestable a pH fisiológico. Se ha reportado
mayor estabilidad de la triple hélice a pH fisiologico gracias a metilaciones de la
citosina (Hausheer F.H. 1992).

La selectividad de la unión entre el TFO y el ADN de doble cadena es igual que
la de los apareamientos de Watson y Crick en la doble hélice. El ligamiento
con el ARN es de afinidadsimilar que con el ADN. En la estructura de la triple
hélice, las regiones del TFO en unión con el dúplex se presentan intercaladas
con secuencias no apareadas.

Cuando estos puentes están formados por dos Pirimidinas la estabilidad del tríplex es máxima. Un mal apareamiento en una sola tripleta desestabiliza la estructura. El grado de desestabilización varía según la ubicación de la tripletano apareada.

Así un mal apareamiento terminal tiene repercusiones mínimas, pero uno central desequilibra por completo la estructura (Mergny J.L. 1991). Por ejemplo, si se trata de un TFO de 21 nucleótidos, la formación de la triple hélice es un fenómeno de todo o nada. Un solo mal apareamiento destruye la triple hélice (Yoon K. 1992).

Regulacion de la replicacion por medio de los TFOs:

Laformación de la triple hélice en el ADN inhibe el paso de las polimerasas y
bloquea la transcripción y la replicación principalmente cuando la triple hélice
se localiza en el sitio de iniciación. La triple hélice impide no solamente el
acoplamiento de la enzima sino también de los factores proteicos requeridos
para la formación del complejo de iniciación (Helene C. 1991). La obstrucción
delsurco mayor de la doble espiral por el TFO obstaculiza el deslizamiento del
fragmento Klenow de la ADN polimerasa a través de las transiciones entre la
doble y la triple cadena.

El efecto inhibitorio depende de la distancia entre el extremo 3' del cebador y el sitio de formación de la triple hélice: deben existir más de tres nucleótidos entre los dos para que el trIplex no interfiera con lareplicación (Guieysse A.L. 1995).

Mientras más larga sea la triple hélice, más efectivo será el bloqueo sobre la acción enzimática, que en promedio dura mínimo veinte minutos. Por ésto, los TFOs pueden utilizarse en estudios funcionales de la polimerización o de la replicación génica (Hacia J.G.1994) o bien en el control de la replicación de genes deletéreos.

Regulacion de la transcripccionpor medio de los TFOs:

La formación de hélices triples por TFOs sobre secuencias reguladoras
Específicas se demostró en un modelo in vitro con la polimerasa de T7. El
oligonucleótido se aparea con las secuencias blanco de homopurinas de los
operadores, de forma antiparalela.

Los TFOs de ARN se aparean con las secuencias de homopirimidinas. Sin embargo, el control sobre la transcripción...
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