Enzimologia

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Guía de Laboratorio de Bioquímica

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Contenidos
Aspectos básicos para la medición de la actividad enzimática……………………….....................................

Pag
02

Características de la Fosfatasa Ácida ……………………………………………………………………………

03

Características de la β-Galactosidasa …………………………………………………………………………

04

LABORATORIO N° 1: Efecto de la concentración de enzima sobre laactividad de Fosfatasa ácida……………

05

LABORATORIO N° 2: Efecto de la temperatura de incubación sobre la actividad de la Fosfatasa ácida………

07

LABORATORIO N° 3. Efecto del pH sobre la actividad de la Fosfatasa ácida…………………………………..

09

LABORATORIO N° 4. Efecto del Tiempo de incubación sobre la actividad de la Fosfatasa ácida………………

11

LABORATORIO N° 5: Efecto de la concentración desustrato sobre la actividad de Fosfatasa ácida .................

13

LABORATORIO N° 6: Estudio de termoestabilidad para dos enzimas…………………………………………..

16

LABORATORIO N° 7: Determinación de km, Vmax y el mecanismo cinético de β-galactosidasa ………………

19

ANEXO. Principios de Fotometría ...…………………………………………………………………………...

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2010
PROFESOR HÉCTOR OLIVARES NUÑEZ

Guía deLaboratorio de Bioquímica

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ENZIMOLOGÍA.
Aspectos básicos para la medición de la actividad enzimática. Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energía muy eficientemente debido a la presencia de catalizadores orgánicos llamados enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgánicos, las enzimas modifican la velocidad de una reacción química sin alterar el equilibrio final de la reacción quecatalizan; además se requieren pequeñas cantidades de enzima para transformar un gran número de moléculas de sustrato. Sin embargo a diferencia de la mayoría de los catalizadores inorgánicos las enzimas son bastante específicas, ya que catalizan un número comparativamente pequeños de reacciones y en algunos casos tan solo una reacción. Por otro lado, las enzimas funcionan solamente bajo condicionesmuy definidas de pH, temperatura, concentración de sustrato, cofactores, etc., propiedades que serán demostradas en algunos de los experimentos de esta unidad. Para controlar y mantener las mejores condiciones (óptimas) en el caso del pH se utilizan soluciones amortiguadoras, las cuales evitan los cambios bruscos del pH que se puedan producir por efecto de la actividad enzimática. La temperaturase mantiene constante incubando el ensayo enzimático en baños termorregulados. Para determinar con exactitud la actividad de una enzima, es necesario conocer muy bien cuál es la reacción que esta cataliza, el o los sustratos y el o los productos de dicha reacción. Además se debe disponer de los métodos analíticos más apropiados para su cuantificación. Para medir o detectar la actividad de unaenzima, se pueden seguir o utilizar dos metódicas: a) midiendo la desaparición del sustrato por unidad de tiempo b) midiendo la aparición del producto por unidad de tiempo. La elección de la metódica adecuada va a depender de la existencia y disponibilidad de los métodos analíticos para cuantificar ya sea el producto o el sustrato de la reacción. En general se prefiere el uso de métodosespectrofotométricos para realizar la cuantificación. También, se debe considerar la realización de los controles apropiados que permitan descartar cualquier interferente en el ensayo enzimático. Entre los controles más utilizados tenemos: 1. Blanco de sustrato: En este control se tienen todos los componentes (reactivos) del ensayo enzimático excepto el sustrato. Uno de los propósitos de este tubo es descartarla existencia de moléculas de sustrato o producto endógeno presente en la preparación enzimática. El otro, es descartar la turbidez, que en muchas ocasiones tiene la preparación de enzima. 2. Blanco de enzima: Este control contiene todos los componentes del ensayo menos la preparación de enzima. Existen ocasiones en que el sustrato sufre modificaciones en forma espontánea, ya sea por efecto de...
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