Espectofotometro

Cromatografía en columna

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el fluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la depositamospor la parte superior de la fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema.
Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de la columna cromatografía, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la columna. En cambio, lassustancias más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que sean arrastradas por estos; El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en unacondiciones cromatografías determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el diámetro que tenga la columna utilizada, etc.




Cromatografía Plana


En la cromatografía sobre papel y en la cromatografía en capa fina la fase estacionaria no se dispone en forma de columna, sino que está constituida, en el primer caso, por una hoja de papel de filtro, y en elsegundo, por una capa de absorbente finamente dividido extendida sobre una placa de vidrio o de plástico. El sustrato a analizar se coloca cerca del borde del papel o de la superficie absorbente en forma de una pequeña mancha circular, obtenida aplicando una frota de la solución de la muestra dejándola secar. Luego, se sumerge este borde de papel o de la placa en el disolvente o que constituye lafase móvil. El disolvente asciende por el pápelo la placa por capilaridad, arrastrando consigo el sustrato. Antes de que alcance el extremo superior del papel o la placa, se detiene el flujo de disolvente retirando el papel o la placa de la cámara de desarrollo y se marca un lápiz la posición alcanzada por el frente del disolvente. Normalmente, el sustrato no se ha desplazado a la misma velocidadque el disolvente, sino que ha quedado retrasado, tanto más cuanto más fuertemente era retenido por el papel o el absorbente sólido. Se señala también la posición de la mancha de sustrato. Si esta mancha es coloreada su localización es inmediata; si es incolora, debe hacerse visible tanto por métodos físicos, como la fluorescencia (emisión de radiación visible al absorber rayos ultravioleta o UV)y la radiactividad (cuando se trabaja con compuestos marcados por isotopos radiactivos) o por métodos químicos, en el cual se utiliza un reactivo químico (revelador) que reacciona con la sustancia dando productos coloreados o fluorescentes(visibles a la luz ordinaria o UV), ejemplos de revelador puede ser solución de (para aminoácidos) o yodo.















CromatografíaBidimensional


La separación de aminoácidos de una mezcla mediante el desarrollo en dos dimensiones. La muestra se coloca en una de las esquinas de una placa cuadrada y se realiza el desarrollo en dirección ascendente con el disolvente A. A continuación se elimina este disolvente por evaporación, y se gira la placa 90 grados, realizando ahora el desarrollo ascendente con el disolvente B. Tras laeliminación del disolvente, se determina la posición de los aminoácidos nebulizando la placa con ninhidrina, reactivo que forma un producto con los aminoácidos de color rosa a púrpura. Las manchas originadas se identifican comparando sus posiciones con las de los estándares. La cromatografía bidimensional se utiliza mucho como instrumento analítico cualitativo y cuantitativo para controlar e...