ESPECTRO DE ABSORCION DE ORTONITROFENOL
Páginas: 6 (1443 palabras)
Publicado: 9 de agosto de 2013
Espectrofotometría de orto-nitrofenol
INTRODUCCIÓN
Uno de los instrumentos principales de un laboratorio de biología celular y bioquímica es el espectrofotómetro.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida. Esto le permite al fisiólogo realizar dosfunciones:
1. Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo midiendo la absorbancia a distintos largos de onda y graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene unarreglo tridimensional de átomos particular que hace que cada sustancia tenga características únicas.
2. Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert:
A = c l A: absorbancia.
: coeficiente de extinción molar
c: concentración
l: distancia que viaja la luz a travésde la muestra (normalmente es de 1 cm)
La cubeta promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centímetro (l). La ecuación describe una línea recta, donde el origen es cero, bajo condiciones ideales.
Si l es constante (1,0 cm) y se conoce el valor de , podemos calcular c en base a:
c = A / l
El coeficiente de extinción se determina realizando una serie de dilucionesde la sustancia de interés. Luego se mide la absorbancia de cada muestra de dilución a una longitud de onda determinada. Los valores de absorbancia son graficados en función de la concentración. El resultado debe ser una línea recta. La pendiente de la línea (Δy/Δx) es el coeficiente de extinción (). Si las unidades de concentración son en moles, entonces la constante es llamada coeficiente deextinción molar y se mide en unidades de /M cm.
La dilución en serie se hace usualmente preparando seis o siete tubos con un volumen dado de solvente, digamos 1 ml, en cada uno. Al primer tubo se le añade un volumen igual (1 ml) de la muestra de interés y se mezcla bien. El tubo tendrá entonces una proporción 1:1 de solvente a sustancia experimental. Es muy importante mezclarbien para distribuir uniformemente las moléculas de la sustancia experimental. De otra forma, habría incongruencias en las lecturas de absorbancia.
De ese tubo 1 se saca un volumen (1 ml) y se echa al tubo 2. Se mezcla bien, y se sigue el proceso con todos los tubos del 3 al 6 ó 7. Al llegar al último, se descarta un volumen de la solución diluída. Al hacer esto obtendremos una dilución enfactor de dos: ½ x ½ x ½ x ½ x ½ x ½ x ½, donde un tubo tiene la mitad de la concentración de la sustancia de interés que el tubo anterior.
V1 C1 = V2 C2
donde V1 y C1 son el volumen y la concentración de la solución que va a ser diluida, mientras que V2 y C2 son el volumen y la concentración de la dilución.
Un error bien común en este procedimiento es el cambiar inadvertidamente los tubos deorden. Es por ello que cada tubo debe estar debidamente rotulado. Otro problema que se presenta es la contaminación con otras sustancias o partículas de polvo. Es por ello que los tubos deben manejarse con cuidado para evitar contaminantes y asegurarse de que están bien limpios antes de usarse. Recuerden que toda materia presenta absorbancia, y si la muestra presenta partículas extrañas, estasalterarán la lectura real de absorbancia. En nuestro caso el aparato hará el ajuste para las moléculas de agua, pero leerá la absorbancia de todo lo demás.
El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz uv y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa...
INTRODUCCIÓN
Uno de los instrumentos principales de un laboratorio de biología celular y bioquímica es el espectrofotómetro.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de un largo de onda particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida. Esto le permite al fisiólogo realizar dosfunciones:
1. Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo midiendo la absorbancia a distintos largos de onda y graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene unarreglo tridimensional de átomos particular que hace que cada sustancia tenga características únicas.
2. Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert:
A = c l A: absorbancia.
: coeficiente de extinción molar
c: concentración
l: distancia que viaja la luz a travésde la muestra (normalmente es de 1 cm)
La cubeta promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centímetro (l). La ecuación describe una línea recta, donde el origen es cero, bajo condiciones ideales.
Si l es constante (1,0 cm) y se conoce el valor de , podemos calcular c en base a:
c = A / l
El coeficiente de extinción se determina realizando una serie de dilucionesde la sustancia de interés. Luego se mide la absorbancia de cada muestra de dilución a una longitud de onda determinada. Los valores de absorbancia son graficados en función de la concentración. El resultado debe ser una línea recta. La pendiente de la línea (Δy/Δx) es el coeficiente de extinción (). Si las unidades de concentración son en moles, entonces la constante es llamada coeficiente deextinción molar y se mide en unidades de /M cm.
La dilución en serie se hace usualmente preparando seis o siete tubos con un volumen dado de solvente, digamos 1 ml, en cada uno. Al primer tubo se le añade un volumen igual (1 ml) de la muestra de interés y se mezcla bien. El tubo tendrá entonces una proporción 1:1 de solvente a sustancia experimental. Es muy importante mezclarbien para distribuir uniformemente las moléculas de la sustancia experimental. De otra forma, habría incongruencias en las lecturas de absorbancia.
De ese tubo 1 se saca un volumen (1 ml) y se echa al tubo 2. Se mezcla bien, y se sigue el proceso con todos los tubos del 3 al 6 ó 7. Al llegar al último, se descarta un volumen de la solución diluída. Al hacer esto obtendremos una dilución enfactor de dos: ½ x ½ x ½ x ½ x ½ x ½ x ½, donde un tubo tiene la mitad de la concentración de la sustancia de interés que el tubo anterior.
V1 C1 = V2 C2
donde V1 y C1 son el volumen y la concentración de la solución que va a ser diluida, mientras que V2 y C2 son el volumen y la concentración de la dilución.
Un error bien común en este procedimiento es el cambiar inadvertidamente los tubos deorden. Es por ello que cada tubo debe estar debidamente rotulado. Otro problema que se presenta es la contaminación con otras sustancias o partículas de polvo. Es por ello que los tubos deben manejarse con cuidado para evitar contaminantes y asegurarse de que están bien limpios antes de usarse. Recuerden que toda materia presenta absorbancia, y si la muestra presenta partículas extrañas, estasalterarán la lectura real de absorbancia. En nuestro caso el aparato hará el ajuste para las moléculas de agua, pero leerá la absorbancia de todo lo demás.
El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz uv y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.