ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE LA α-AMILASA

ENZIMOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
PRÁCTICA 1
ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE LA α-AMILASA


INTRODUCCIÓN

La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada
(amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa)
para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como
enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina,acrodextrina y
maltodextrina) con poca producción de maltosa.
El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa
en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhídrido
carbónico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentables que estén
presentes en la masa, y cuya formación depende, a su vez, de la acción
sincronizada de la alfa- y labeta-amilasa; en mejor forma que por adición de
extracto de malta usado también para este objeto. Mientras los cereales
germinados contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes
en alfa-amilasa, siendo entonces conveniente su adición.
Para poder aplicar correctamente su uso es importante conocer como la
enzima en cuestión trabaja, es decir conocer los parámetros de su actividadcinética.
La velocidad de una reacción química puede medirse como la velocidad de
formación de uno o más de su productos o bien la velocidad de utilización de
sus reactivos. Intuitivamente podemos suponer que al aumentar la
concentración de los reactivos la probabilidad de interacción de los mismos
aumenta conjuntamente con la velocidad que procede tal reacción. Ambas
variables (velocidadde reacción y concentración de los reactivos) son
directamente proporcionales. Por ello en esta prácticamente hemos usado
diferentes concentraciones se sustrato para ver cómo influye en la velocidad. A
partir de estos valores obtenemos la Km y Velocidad máxima, parámetros
necesarios para ver la actuación de las enzimas.

MATERIALES Y MÉTODOS

-

Añadir tampón y sustrato en cada tubosegún la se muestra en la tabla y
dejar actuar por el tiempo que se marca en cada tubo, excepto en el
blanco que solo llevará tampón.

4’

6’

8’

12’

20’

X ml tampón
Y ml sustrato

+ 1 ml de extracto enzimático

Detener reacción enzimática
en hielo.

+ 2 ml ác. 3-5 dinitrosalicílico
(Forma compuesto color pardo)

Inactivar enzima a 100ºC durante
5 segundos

Cuantificarglucosa Medida
absorbancia 590 nm

B

4 ml tampón
X
Tampón (ml)
3
2.5
1.5

Y
Sustrato (ml)
1
1.5
2.5

Resultados

1. Cuantificación de la glucosa
La cuantificación de la glucosa (g/L) se llevó a cabo mediante medición de la
absorbancia de las diferentes concentraciones de sustrato a tiempos diferentes. Los
resultados de esta cuantificación se muestran en las tablas 1-5.
Laecuación para la cuantificación es: [glucosa g/L] =
Tabla 1. Concentración glucosa (g/L)
en 0.5 ml sustrato.

Tiempo
0
4
6
8
12
20

0,5 ml sustrato
Absorbancia
0
0,18
0,108
0,191
0,184
0,191

Glucosa
0,0023
0,1155
0,0703
0,1225
0,1181
0,1225

Tabla 3.3. Concentración glucosa (g/L)
Tabla
en 2 ml sustrato.

Tiempo
0
4
6
8
12
20

2 ml sustrato
Absorbancia
00,562
0,568
0,584
0,612
0,665

Glucosa
0,0023
0,3558
0,3596
0,3696
0,3872
0,4206

Tabla 5. Concentración glucosa (g/L)
en 3 ml sustrato.

Tiempo
0
4
6
8
12
20

3 ml sustrato
Absorbancia
0
0,628
0,713
0,722
0,768
0,776

Glucosa
0,0023
0,3973
0,4508
0,4564
0,4853
0,4904

.
.

Tabla 2. Concentración glucosa (g/L)
en 1.5 ml sustrato.

Tiempo
0
4
6
812
20

1,5 ml sustrato
Absorbancia
0
0,462
0,382
0,429
0,49
0,52

Glucosa
0,0023
0,2929
0,2426
0,2721
0,3105
0,3294

Tabla 4. Concentración glucosa (g/L)
en 2.5 ml sustrato.

Tiempo
0
4
6
8
12
20

2,5 ml sustrato
Absorbancia
0
0,546
0,623
0,486
0,566
0,535

Glucosa
0,0023
0,3457
0,3942
0,3080
0,3583
0,3388

2. Determinación de la velocidad de la...