explicacion de tpnc2ba 3 2012

Explicación de TP Nº 3

Reacción en cadena de la
Polimerasa (PCR)
Química Biológica Patológica
Bioq. Mariana L. Ferramola
2012

Definición de PCR
 Es la amplificación enzimática de un fragmento deinterés
(DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).
 Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de
interés.

Componentes del sistema de PCR
 ADN molde
 Oligonucleótidos(cebadores o primers)
Máster
Mix

 Polimerasa termoestable
 Solución buffer
 dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)

Componentes del sistema de PCR: ADN molde
El ADN molde puede ser de cadena sencilla odoble, circular
o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN
se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.
 Deben tenerse en cuenta los posibles contaminantes
presentes en elADN molde, que pudieran disminuir la
eficiencia de reacción:
 Urea
 SDS
 Acetato de sodio
 Agarosa
 Fenol
La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida.
Demasiada cantidadde ADN puede inhibir la reacción de PCR.

Componentes del sistema de PCR: ADN molde

Componentes del sistema de PCR: cebadores
 Longitud de la región complementaria al ADN molde de
entre 18-25pb.
Deben ser específicos.
 No deben presentar auto-complementariedad.
 No deben ser complementarios entre ellos.
 El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.
 El Tm de los oligos no debe diferiren más de 5ºC.
 La diferencia entre el Tm de los oligos y del amplicón no
debe superar los 10ºC.
 Su concentración debe ser de entre 0.1-1μM
(concentraciones excesivas pueden dar lugar ainespeficidad de amplificación).

Componentes del sistema de PCR: polimerasa
termoestable
Las ADN polimerasas termoestables presentan las siguientes
características:
Polimerizan en dirección 5’→ 3’.
Necesitande un extremo 3’-OH libre para comenzar la
polimerización.
Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que
sirve de molde.
Necesitan la presencia de Mg para funcionar.
Son capaces de...