Extracciion de adn

Páginas: 8 (1971 palabras) Publicado: 12 de marzo de 2011
Se utilizaron en el estudio 10 ejemplares de T. flavida colectados en la cueva Caimanera, Península de Guanahacabibes, Pinar del Río, Cuba. A los 10 triatomas colectados se le aisló el ADN genómico a partir de una pata, utilizando 5 métodos de extracción diferentes.
Método de calentamiento: la pata fue homogeneizada de forma manual en nitrógeno líquido y 50 µL de agua destilada. Se incubó a 93°C durante 15 min. Se realizó una centrifugación a 8 000 g por 10 min y el sobrenadante se conservó a - 20 °C.
Método fenol-cloroformo:3 la pata fue homogeneizada de forma manual en nitrógeno líquido y 1 mL de tampón de lisis (tris-HCl 50mM pH 8,25; EDTA 50 mM; NaCl 50 mM; SDS 1 %). La suspensión se incubó con 2 mg/mL de proteinasa K (Boehringer Mannheim) toda la noche a 37 °C y seguidamente serealizaron 3 extracciones de proteínas con igual volumen de fenol, fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), con sus respectivas centrifugaciones a 8 000 g por 10 min a 4 °C. El ADN se precipitó con 2 volúmenes de etanol absoluto y 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M pH 5,3; durante 30 min a - 20 °C. El precipitado de ADN genómico que se obtuvo porcentrifugación a 10 000 g durante 20 min se lavó con etanol 70 % y se secó a temperatura ambiente; fue resuspendido finalmente en 50 mL de tampón tris-EDTA (TE) (tris-HCl 1 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0). El ARN presente en la muestra se digirió con la adición de RNasa H (Boehringer Mannheim, Germany), incubándose durante 1 h a 37 °C. Seguidamente se realizó una extracción empleando un volumen decloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y el sobrenadante se conservó a - 20 °C.
Método del acetato de potasio:8,9 la pata fue homogeneizada de forma manual en 100 µL de tampón de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2 M; EDTA 50 mM; tris-HCl 100 mM pH 8,25; SDS 0,05 %). La suspensión se incubó durante 30 min a 65 °C. Los ácidos nucleicos se extrajeron adicionando 14 µL de acetato de potasio 8 M incubándose enhielo durante 15 min, seguido de una centrifugación a 8 000 g durante 10 min a 4 ºC donde se colectó la fase acuosa. El ADN se precipitó a - 20 ºC durante 30 min en presencia de 2 volúmenes de etanol absoluto que contenía acetato de sodio 0,3 M. Posteriormente, se centrifugó la mezcla a 10 000 g durante 20 min y el precipitado se lavó con etanol (70 %). Después de secar a temperatura ambiente, el ADNse disolvió en 50 µL de tampón TE. El ARN restante se eliminó con RNAsa H (Boehringer Mannheim), la suspensión se incubó a 37 ºC durante 1 h. Después de extraer con igual volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), la fase acuosa se conservó a - 20 °C.
Método del acetato de potasio modificado: la pata fue homogeneizada de forma manual en nitrógeno líquido y 150 µL de tampón de lisis(tris-HCl 20 mM pH 8,25; EDTA 25 mM; NaCl 25 mM; SDS 1 %). La suspensión se incubó con 100 µg/mL de proteinasa K (Boehringer Mannheim) durante 1 h a 56 °C. Los ácidos nucleicos se extrajeron adicionando 100 µL de acetato de potasio 3 M incubándose en hielo durante 1 h, seguido de una centrifugación a 8 000 g durante 10 min a 4 ºC donde se colectó la fase acuosa. El ADN se precipitó a - 20 ºC durante 30min en presencia de 2 volúmenes de etanol absoluto que contenía acetato de sodio 0,3 M. Posteriormente, se centrifugó la mezcla a 10 000 g durante 20 min y el precipitado se lavó con etanol (70 %). Después de secar a temperatura ambiente, el ADN se disolvió en 50 µL de tampón TE. El ARN restante se eliminó con RNAsa H (Boehringer Mannheim), la suspensión se incubó a 37 ºC durante 1 h. Después deextraer con igual volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1), la fase acuosa se conservó a - 20 °C.
Método de bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB):10 la pata fue homogeneizada de forma manual en nitrógeno líquido y 500 µL de tampón de lisis (tris-HCl 20 mM pH 8,25; EDTA 25 mM; NaCl 25 mM; SDS 1 %). La suspensión se incubó con 100 µg/mL de proteinasa K (Boehringer Mannheim) durante 1 h...
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