Extraccion de adn en orina

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ENSAYO
Elegimos el protocolo “Análisis de microsatélites en células exfoliadas del sedimento urinario. Su utilidad para la detección del cáncer vesical.Estudio comparativo con citología urinaria” ya que en este se realizo una extracción de ADN en un medio liquido (orina)

La muestra se centrifugaba durante10’ a 2000 rpm

,se decantaba el sobrenadante para posteriormente realizardos lavados con solución buffer.

Se añade 400 ul de Tris, 10 nM pH 10.5,

EDTA1 nM,

ClNa 0,15 m.,

agregando luego SDS al 10%

y 10 ul de proteinasa K.

Se encubaba a 56°C durante 24 hs y posterior purificación confenol/cloroformo.

Luego de la extracción todas las muestras eran congeladas a -20° hasta su amplificación con PCR. (Reacción de la cadena de la polimerasa)La reacción de la cadena de la polimerasa(PCR) se utilizó para la amplificación del DNA con cada uno de los marcadores. El programa consistía en unadesnaturalización inicial a 95°C durante 5 minutos, 35 ciclos de [95°C 30 seg -55°C 30 seg - 72°C durante 10 minutos] y un paso de elongación final a 72°C durante 10minutos.

Posteriormente se modifico con los marcadores D9S747 y D9S171 a la temperatura de unión con los cebadores de 55 a 60°C.

El producto de PCR sesometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1% para comprobar la eficacia de la reacción

Por último se realizaron geles de poliacrilamida al 12% de 40x 50 cm

La electroforesis se lleva a cabo a 1600 voltios durante 190 minutos y la detección del producto de PCR se realizó por tinción de plata.
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