Extraccion De Adn Para Listerya Monocytogenes

julio-diciembre de 2005 UNIVERSITAS SCIENTIARUM Revista de la Facultad de Ciencias
Vol. 10, N° 2, 61-78

ESTANDARIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE ADN Y VALIDACIÓN DE LA PCR MÚLTIPLE PARA DETECTAR Listeria monocytogenes EN QUESO, LECHE, CARNE DE RES Y POLLO
R. Poutou1, M. Burbano2, S. Sierra1, 2, K. Torres1, 2, A. K. Carrascal2, M. Mercado2, 3
Laboratorio de Biotecnología Aplicada; 2Laboratorio deMicrobiología de Alimentos. Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial; 3Grupo de Enfermedades Infecciosas Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Cra. 7ª No. 40-62 Bogotá, Colombia rp000274@javeriana.edu.co RESUMEN Este trabajo validó la técnica de PCR para la detección de L. monocytogenes a partir de ADN de cultivos puros y en muestras de lechescrudas, quesos frescos, carne de res y carne de pollo. En DNA de cultivos puros la sensibilidad, la especificidad y la reproducibilidad encontrada fue de 100%, 101UFC/ml y K=1, respectivamente. Para la extracción del ADN de los alimentos se emplearon dos métodos, el primero, basado en la precipitación alcohólica en presencia de NaI, lo que redujo en gran medida las grasas; permitiendo ladetección directa de 10 1 UFC/ml en leche cruda y 105 UFC/g en queso fresco. El segundo método, basado en la extracción con lisozima, proteinasa K y fenol-cloroformo, permitió establecer límites de detección de 102 y 104 UFC/g para las carnes de res y pollo respectivamente. La PCR se basó en la especificidad de los iniciadores LI1/U1 que amplificaron una banda de 938 pb (identificación de género)característica del rDNA 16S y los iniciadores LF/LR que amplificaron una banda de 750 pb característica del gen hlyA (identificación de especie). Los resultados de la validación reportaron con relación al método “Gold Standard” una reproducibilidad, sensibilidad y especificidad del 100% en leches crudas. Para las muestras de queso frescos se reportó una reproducibilidad de 97%, sensibilidad 96.3% yespecificidad del 100%, para la carne de pollo la reproducibilidad fue 98.43%, sensibilidad 96.9%, especificidad 100%, valor predictivo positivo 100% y valor predictivo negativo 100%, para la carne de res todos los parámetros fueron 100%. El método “Gold Standard” reportó 100% para todos los parámetros. El trabajo muestra que ambas técnicas pueden ser utilizadas para detectar L. monocytogenes en este tipode alimentos y que la PCR reduce el tiempo de ensayo considerablemente. Palabras clave: validación, PCR múltiple, Listeria monocytogenes, leches crudas, quesos frescos, carnes crudas de res y pollo ABSTRACT The object of this project was to validate the PCR technique for the detection of Listeria monocytogenes using DNA purified from pure cultures, samples of raw milk, fresh cheese, raw beef andchicken. In DNA from pure cultures the sensitivity, specificity and reproducibility were 100%, 101CFU/ml and K=1, respectively. Two DNA extraction procedures were used. The first was based on alcohol precipitation in the presence of NaI, which reduced the fat content considerably; allowing the direct detection of 10 1 CFU/ ml in raw milk and 105 CFU/g in fresh cheese. The second method was basedon DNA extraction with lysozyme, proteinase K and phenol-chloroform. This method allowed the establishment of the detection limits at 102 and 104 CFU/g for raw beef and chicken, respectively. The PCR was based on the specificity of primers LI1/U1 that amplified a 938bp band (genus identification) characteristic of 16S rDNA, and the primers LF/LR that amplified a 750 bp band characteristic of thehlyA gene (species identification). Validation results gave a reproducibility, sensitivity and specificity of 100% in relation to the Gold Standard method for raw milk. In fresh cheese there was a reproducibility of 97%, a sensitivity of 96.3% and a specificity of 100%. Raw beef tests gave a reproducibility of 98.43%, a sensitivity of 96.9%, a
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