Extraccion de adn

Páginas: 2 (302 palabras) Publicado: 4 de marzo de 2011
PROTOCOLO DE OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN
GENÓMICO)

Pesar 70 mg de muestra botánica procesada, agregar 700 l de buffer de extracción (Tris HCl pH 8.0, NaCl 1.4 M, EDTA 20mM, CTAB 2%, PVP 1%, 2 – mercaptoetanol 1%). Luego triturar con ayuda de un mortero y pilón. Seguidamente Incubar el triturado a 65º por 45 min. homogenizando cada 15 minutos.Dejar a temperatura ambiente por 5 min. Seguidamente agregar 700 μl de cloroformo – alcohol isoamílico (24:1) a cada tubo, mezclar por 5 minutos, con cuidado para evitar “romper” elADN y centrifugar a 14000 rpm/5 minutos.
Retirar el sobrenadante a otro tubo y agregar 80 μl de CTAB 10X; posteriormente mezclar por inversión por 5 min; y luego repetir elpaso anterior. Retirar con mucho cuidado el sobrenadante evitando de no contaminarlo con la interfase; a este sobrenadante agregar isopropanol frió (proporción 1:1) y mezclar porinversión, posteriormente dejar en la nevera por 2h. Luego centrifugar a 14000 rpm/15 minutos y decantar el sobrenadante, dejando los tubos invertidos sobre papel secante o papeltoalla por tres minutos. Posteriormente lavar el precipitado con 1 ml de etanol al 70% haciendo que este se desprenda del fondo del tubo, luego centrifugar a 14000 rpm/15 minutos,decantando el sobrenadante y dejando los tubos invertidos sobre papel secante o papel toalla por dos minutos.
A continuación lavar el precipitado con 1 ml de etanol al 95%haciendo que este se desprenda del fondo del tubo, luego centrifugar a 14000 rpm/10 minutos y eliminar el sobrenadante, dejándose los tubos invertidos sobre papel secante o papeltoalla por dos minutos.
Luego agregar por cada precipitado 130 μl de buffer TE, dejándose disolver por una dos horas. Agregar 1 l de ARNasa e incubar a baño maría por 30 minutos
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